2020 Fiscal Year Annual Research Report
Precise reconstruction of complex biological tissue by flexible processing of "porous" matrix
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20H02529
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
関 実 千葉大学, 大学院工学研究院, 教授 (80206622)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 真澄 千葉大学, 大学院工学研究院, 准教授 (30546784)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | バイオマテリアル / 細胞培養 / ハイドロゲル / コラーゲン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の初年度に当たる2020年度には，細孔が血管網として機能する「3次元的かつ多孔性」の細胞培養系を構築するための新規手法を開発した。まず，タンパク質（主に光架橋性ゼラチン）および合成ポリマーからなる「共連続な水性2相分離系」を利用したスポンジ状ゲルの作製手法，マイクロ流体デバイスを用いて作製した細胞導入型の犠牲ファイバーをハイドロゲルに導入しその後除去することで多孔性ゲルを作製する手法，精密に作製したコラーゲン等のECM成分からなる微小材料（粒子，断片化ファイバー，中空糸）を用いて複数種の細胞を組織化する手法，について，それぞれの有用性および細胞培養への適用可能性を探索することとした。共連続な水性2相系を用いる手法については，培養肝細胞および線維芽細胞の共培養を行った。また，断片化コラーゲンファイバー，繊維芽コラーゲン微粒子，およびゼラチンファイバーの作製については，マイクロ流路を用いた手法に加えて，微小ノズルを用いることによるスケールアップ手法を構築した。さらに，犠牲材料となるアルギン酸ハイドロゲルファイバーを溶解することで，フィブリンからなる毛細血管網を迅速に形成する手法を開発した。特に，血管内皮細胞を生きたままファイバーに導入し，かつその形状を制御する手法を開発することができた。
これらの材料や培養系については，主に肝細胞をターゲットとし，培養肝細胞に加えてラットから単離した初代肝細胞を対象として培養を行った結果，いくつかの培養系において，肝細胞の機能が有意に向上することが確認された。さらにこれらの実証に加えて，スポンジ状基材に形成したマイクロチャンバーを用いるフロースルー細胞培養系の構築や，微小ゼラチン粒子を用いた動物細胞の懸濁培養系などの新規細胞培養系を提案し，それらの有用性を検証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年当初はコロナ禍の影響があり，特に幹細胞培養に関する実験は当初の想定通りに進まず，経費の一部については2021年度に繰り越した。若干の研究の遅れは生じたものの，コラーゲンやゼラチン，フィブリンなどの細胞活性のある素材を種々の形状に加工するプロセスをある程度確立でき，さらに，水性2相分散系や犠牲材料を用いる手法によって，多孔性の細胞培養基材を加工する手法を確立できた。そしてまた，肝細胞を中心として3次元培養の有用性を示した。これらの結果を総括すると，概ね想定通り研究が進捗したものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の2年度目に当たる2021年度は，2020年度に引き続き，細孔が血管網として機能する「3次元的かつ多孔性の」細胞培養系の開発を継続する。これまでの検討では，ハイドロゲルからなる溶解性のマイクロファイバーを，細胞培養用ハイドロゲルの内部に導入した上で，ファイバーを除去することでスポンジ状の材料を形成させた。本年度はまず，マイクロ流体デバイスの内部において同様のプロセスを行うことで，細胞を内部に導入したスポンジ状材料を形成させる。この材料に対して供給する培養液の流れを制御しすることで，細胞の機能発現や分化制御が可能になるかどうか，遺伝子発現の定量評価および蛍光免疫染色などによって評価を行う予定である。さらに，コラーゲンやゼラチンなどの細胞活性材料からなるマイクロファイバーや微粒子を，細胞培養のための足場基材として3次元的に集積化することで，肉厚なシート状の組織を高速に形成するための手法を開発するほか，流路内部におけるハイドロゲルの高密度パターン化，多孔性基材と流路構造を組み合わせた細胞の3次元かん流培養デバイスの開発などを継続し，発展させる。これまでに，血管内皮細胞としてはHUVECやHH細胞を用いてきたが，本年度は，間葉系幹細胞や，特に創薬への応用において有用である肝細胞や皮膚由来線維芽細胞などを実質細胞として導入することで，複数種の細胞からなる共培養系を実現する予定である。これらの細胞の機能評価を通して，種々の微細加工技術を駆使して形成したバイオマテリアルの，特に動物細胞培養における有用性を実証すべく，引き続き検討を行う。
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