2020 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of technique for supersaturation control in liquid cell transmission electron microscopy and its application to protein crystallization
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20H02580
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
山崎 智也 北海道大学, 低温科学研究所, 特別研究員(PD) (50735032)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | タンパク質結晶 / 結晶化 / その場観察 / 透過型電子顕微鏡 / 溶液セル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
溶液セルを用いた透過型電子顕微鏡法（TEM）は、溶液中の現象を高い時間・空間分解能で観察することが期待できる手法である。そのため、これまで捉えることが困難であった結晶化の初期過程を視覚化できると期待されている。一方、高い空間分解能で結晶化を捉えるためには、観察している視野内で結晶化をおこす必要がある。しかし、これまでの溶液セルを用いたTEMでは、観察視野内で過飽和度を高くし、結晶化を促進させる有効な手段がなかった。本研究課題はこれを解決し、タンパク質の結晶化を捉え、その核生成前後の描像を明らかにすることを目指す。
本年度はまず、溶液セル中に電極を導入し、誘電泳動力によって粒子を電極に集める手法について検討した。既存の電極を搭載したチップでは、電極間の距離が長いため、タンパク質分子には有効な力を与えることはできない。そのため、粒径の比較的大きなコロイド粒子を試料として用い、溶液セルを作製した。電極に電場を印加することで、コロイド粒子がどのように振舞うのかを観察した。その結果、最適な周波数条件においては、まず粒子が鎖状に連なり、それが電極周囲に集まる様子が観察された。また、それらが電場勾配の大きな方向に運ばれることで2次元的な結晶を作ることが分かった。同様な溶液セルをタンパク質分子に適応できるようにすることで、同様の現象がタンパク質においても観察されることが期待される。これを実際に示すために、タンパク質の結晶化用溶液セルを設計し、作製に着手した。
また、溶液セルを冷却することで過飽和度を制御する手法を検討するため、一般的なTEM試料ホルダーに用いることができる溶液セルを複数の種類について作製し、溶液を封じるために最適な溶液セルを検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、タンパク質の結晶化に適応した溶液セルを設計、作製する予定であった。これに対し、コロイド粒子を用いて実験系をスケールアップする手法を考案し、溶液セルを設計するためのデータ収集を行った。その過程で当初の計画にはなかったコロイド粒子を制御して結晶化する方法を発見することができた。これはタンパク質の結晶化に対しても応用が期待できる。また、溶液セルを冷却する手法も考案することができた。
研究はほぼ当初の計画通りに進んでおり、さらに当初の計画では予測できなかった成果も得られたため、当初の計画以上に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度得られた成果を踏まえ、タンパク質の結晶化に適応した溶液セルの作製を完了させ、これを用いてタンパク質の結晶化実験を行う。実験では、溶液条件や印加する電場のパラメータを変えることで、結晶化に最適な条件や、結晶化条件に応じた結晶化挙動の振舞いを解析する。また、溶液セルを冷却して過飽和度を制御する手法が実現できるかを検討する。この目途がたった場合、この手法に適した溶液セルの作製に着手する。
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