Direct single-molecule observation of the elementary process of molecular complex formation regulated by the compartmentalized plasma membrane

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H02585
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 藤原 敬宏 京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (80423060)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 1分子観察 / 超解像観察 / 細胞膜 / アクチン膜骨格 / 閉じ込め効果

Outline of Annual Research Achievements

分子反応を本質的に制御していると考えられる「閉じ込め効果」の生体内での直接測定は、測定技術の時間／空間精度の限界のためにこれまで極めて困難であった。本研究ではその技術的限界を打破し、細胞膜上のアクチン膜骨格の仕切りを超解像観察しながらその中での分子反応の素過程を1分子直接観察することにより、「閉じ込め効果」の原理の理解の飛躍的な加速を目指す。この目的を達成するため、以下の5段階で研究を推進する。
[1] 25μs時間分解能での1蛍光分子追跡の達成、[2] 5秒間でのアクチン膜骨格の仕切りの生細胞超解像観察の実現、[3]「分子衝突局所増幅効果」の1分子直接観察、[4]「オリゴマー誘起トラッピング効果」の1分子直接観察、[5]「機能ドメイン動的複合体」形成制御機構の解明。令和2年度は [1]、[2]を目標とし、以下の研究進捗があった。
(1) 1蛍光分子追跡の時間分解能の改善
赤感度増強型GaAsP光電面を搭載したイメージインテンシファイア－を導入し、還元剤の添加で信号の暗状態 (ブリンキング、ブリーチ) を抑制することにより、時間分解能25μs において、平均50 nm以下の位置決め精度で連続100フレーム以上 (全体の7%) の1蛍光分子観察をおこなった。
(2) 5秒間でのアクチン膜骨格の仕切りの生細胞超解像観察の実現
アクチン超解像プローブと標識に使用する蛍光分子の選定をおこなった。光変換型蛍光タンパク質mEos3.2標識Lifeactペプチドプローブでは、約100 nmの細かい仕切りを空間的に分解するのに十分なシグナルが得られなかったため、Haloタグ融合Lifeactを自発的高速明滅をおこなう有機蛍光色素で標識する方法に変更し、5秒間の生細胞観察 (3 kHzで15,000フレーム) でアクチン膜骨格の仕切りの超解像画像を取得することが可能になった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

長波長領域におけるシグナル検出効率を向上することで、時間分解能の改善を図るためのイメージインテンシファイア－の導入が、新型コロナウイルス感染症の影響に伴う部品供給元での材料の入荷遅延、供給元工場の稼働制限が発生したことにより、当初の予定より約2か月延期された。しかし、薬剤添加による蛍光分子の暗状態の抑制方法の検討など、その他の方策による改善を先行して進め、遅れて導入された装置によって、目標とした時間分解能25μsでの1蛍光分子観察をおこなった。さらなる位置決め精度、連続観察時間の改善が望まれるため、令和3年度も、より高速観察に適した蛍光プローブの探索と観察条件の検討を継続する。アクチン膜骨格の仕切りの生細胞超解像観察については、予定通り、目標とした5秒間での超解像画像の取得を実現した。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度は、1分子高速運動観察とアクチン膜骨格の仕切りの超解像同時観察により、「分子衝突局所増幅効果」と、「オリゴマー誘起トラッピング効果」の直接観察をおこなう。
(1)分子衝突局所増幅効果
以前、モンテカルロシミュレーションにより、同じ仕切りの中に入った分子同士の単位時間当たりの衝突が、仕切りがない場合の平均の10倍以上の頻度で起こり、分子間会合が局所的に増幅されるというモデルを示した。それにより、いったん解離しても、同じ仕切りの中にいる間は再会合する確率が高く、見かけのオフレートが下がる、また、仕切りが小さいと衝突頻度が上がり、再会合も起こりやすくなることで、分子複合体形成が誘導／安定化され、アクチン膜骨格の密度依存的な、シグナル伝達効率の制御が可能になる、という効果が予測されるが、これらの仮説を1分子観察により直接検証する。
(2)オリゴマー誘起トラッピング効果
仕切りがない場合はオリゴマーが形成されても拡散運動にほとんど影響がないが、モノマーに比べてダイマー／オリゴマーに対する仕切りの「閉じ込め効果」はずっと大きいので、仕切りの存在により長距離の拡散が大幅に抑制される、というモデルである。それにより、分子会合状態によって、仕切りごとのホップ拡散の滞在時間が異なる、また、シグナル分子複合体が大きくなってトラップされると、「分子衝突局所増幅効果」もあり、その場所でさらに複合体が成長し、安定な機能ドメイン形成が誘導される、という効果が予測されるので、これらの仮説を1分子観察により直接検証する。