2021 Fiscal Year Annual Research Report
エピゲノム理解を目指した1分子レベル・クロマチン凝縮プロファイル動態解析技術開発
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20H02591
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小穴 英廣 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (20314172)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マイクロ流体デバイス / 1細胞解析 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
溶液の塩濃度を生理的塩濃度よりも少し高くすると、静電相互作用が弱められた結果、染色体を構成しているタンパクの一部が解離をはじめ、染色体が穏やかに解きほぐれてくることが知られている。本研究課題においては、この染色体が穏やかに解きほぐれた際に観察される、クロマチンファイバーに沿った凝縮/脱凝縮部分の分布及びその動態とヒストンタンパクの化学修飾の分布との相関を1細胞・1分子レベルで解析する手法を新奇マイクロ流体デバイス開発を通じて実現する事を目指している。
本年度は、昨年度に引き続き、解きほぐした染色体に張力が均一な直線状の形態を取らせるための、微小構造を持つマイクロ流体デバイスの開発・改良に取り組んだ。クロマチンファイバー（解きほぐした染色体）の両端を抗体修飾マイクロビーズを介して微小構造へ固定した後、溶液条件の変更などによりクロマチンファイバーが更に解きほぐされ、撓んだ形態となったときに、改めてクロマチンファイバーを直線状形態にすることができるよう、マイクロ流路中に微小構造を複数個配置し、それらの微小構造への固定を可逆的にできるようにした。ここで、クロマチンファイバー及びクロマチンファイバーを捕捉しているマイクロビーズが微小構造へ吸着してしまうという問題が生じたため、マイクロ流路内を中性高分子でコーティングする方法を開発した。これにより、クロマチンファイバー及びクロマチンファイバーを捕捉しているマイクロビーズが微小構造へ吸着する現象を抑えることができた。
また、染色体をマイクロ流路内で操作するために用いている光ピンセットシステムを改良し、クロマチンファイバーにかかっている力を計測できるようにした。これにより、クロマチンファイバーの伸びと張力との関係を調べることを達成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題においては、染色体が穏やかに解きほぐれた際に観察される、クロマチンファイバーに沿った凝縮/脱凝縮部分の分布及びその動態とヒストンタンパクの化学修飾の分布との相関を1細胞・1分子レベルで解析する手法を新奇マイクロ流体デバイス開発を通じて実現する事を目指している。この実験操作においては、クロマチンファイバー（解きほぐした染色体）の両端を抗体修飾マイクロビーズを介して微小構造へ可逆的に固定できることが必要となっている。前年度までの実験において、クロマチンファイバー及びクロマチンファイバーを捕捉しているマイクロビーズが微小構造へ吸着してしまうという問題が生じていたため、今年度は、マイクロ流路内を中性高分子でコーティングすることに取り組み、クロマチンファイバー及びクロマチンファイバーを捕捉しているマイクロビーズが微小構造へ吸着する現象を抑えるためのコーティング条件を見出すことができた。
また、クロマチンファイバーに沿った凝縮/脱凝縮部分の分布やヒストンタンパクの化学修飾の分布を調べる際に、その時のクロマチンファイバーに懸かっている張力を計測する実験系の開発にも取り組んだ。この実験系を用いることで、クロマチンファイバーの一端を光ピンセットで引っ張りながら、ファイバーの凝縮部分が徐々に解かれていく様子を観察しつつ、その時の張力変化を測定することができた。そして、張力が30 pN程度を越えるあたりから、クロマチンの折り畳み構造の破壊が起きていることを示唆する結果が得られた（投稿準備中）。
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| Strategy for Future Research Activity |
1分子レベルでのクロマチン凝縮プロファイル動態観察を行うため、両端固定した染色体/クロマチンファイバーに対し、化学修飾を受けたヒストンに特異的に結合する蛍光ラベル抗体を用いたマルチカラー免疫蛍光染色を行い、クロマチンファイバーに沿った凝縮部/脱凝縮部の分布との位置の相関を明らかにする。試料には、引き続きマウスES細胞を用い、既知のエピジェネティクス解析データと比較することで、顕微鏡下での個々のクロマチンファイバーに対するエピジェネティクス解析手法の再現性と信頼性を確認することに取り組む事を計画している。ここで、これまでは、抗体修飾マイクロビーズの抗体には、抗RFP抗体を用いてきている。この抗体修飾マイクロビーズでも、染色体の両末端付近を捕捉することはできているが、この末端捕捉のための標的タンパクとして、テロメア結合性タンパクの有用性について検討を行う。また、各染色分体をそれぞれ別の辺最構造へ固定する事を意図した、染色分体分離の条件探索にも取り組む。
これまでに、染色体/クロマチンファイバーを均一な張力で伸張し保持する時の両端に懸かっている力についての見積を行っており、その結果から、染色体折り畳み高次構造の詳細についての知見が得られる可能性のあるデータが得られつつある。今年度も引き続き、この染色体/クロマチンファイバーの伸びと張力の関係について調べ、染色体折り畳み高次構造の詳細について明らかにしたいと考えている。
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