2020 Fiscal Year Annual Research Report
Research and development of real-time microscopic analysis technique for investigating protein-aggregation process
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20H02608
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| Research Institution | Ibaraki National College of Technology |
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Principal Investigator |
若松 孝 茨城工業高等専門学校, 国際創造工学科, 教授 (80220838)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
植 英規 福島工業高等専門学校, 電気電子システム工学科, 准教授 (90586851)
尾形 慎 福島大学, 食農学類, 准教授 (10532666)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | タンパク質 / ナノ粒子 / 凝集体 / タンパク質凝集 / 相分離 / 光散乱 / リアルタイム分析 / 顕微分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度は、タンパク質溶液サンプルの温度制御、及び顕微分析用の位置制御機構を除く、分析装置全体の設計・製作を行った。細いレーザ光ビーム(波長473 nm,25 mW)を対物レンズで集光し、薄いセルに注入した測定サンプルに照射して、サンプルからの微弱な低角度の前方光散乱光を抽出する。アレイ状素子のCCD光検出器で前方静的光散乱(F-SLS)を瞬時に測定し、さらに高感度CMOSカメラで前方散乱光を動画撮影してF-SLSと前方動的光散乱(F-DLS)を同時にリアルタイムで計測する光学系を構築した。また、分析対象予定の代表的なタンパク質の凝集体サンプルの作製と評価、及びタンパク質架橋反応凝集に使用する糖鎖リガンドの設計と作製を行った。
シリカ粒子(0.5μm)やポリスチレン粒子(0.1μm,0.5μm)の分散液、及びリゾチームタンパク質(4 nm)の凝集溶液を測定サンプルに用いて、開発した分析装置の動作・性能テストを行った。単一粒子分散のサンプルでは、低濃度でも集光レンズの作用により、十分な光散乱強度が得られ、平行光ビーム照射による従来の開発分析装置よりも約100倍以上感度が向上し、微量の低濃度サンプルでも測定対象可能であることが分かった。また、塩添加で結晶化する条件のリゾチーム溶液では、電解質イオンの作用でリゾチームが液‐液相分離で凝集する状態変化をリアルタイムで高感度に捉えた。リゾチーム溶液への塩添加後、前方光散乱強度が増大し、計測したF-DLSの解析から周波数パワースペクトルが時間経過で低周波側へシフトした。
一方、集光したレーザ光の照射で計測したF-SLSプロファイル(散乱光の空間的放射特性)が、従来の分析方法(装置)で測定した結果と異なり、F-SLSデータから凝集体の構造(フラクタル次元)を評価するには、補正処理を行う必要あることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度の実施計画で主な目標であった、タンパク質溶液サンプルの温度制御、並びに顕微分析用の位置制御機構を除く、装置全体の基本設計と主要光学系のセットアップを行い、微粒子分散液とタンパク質凝集化サンプルを使用してその基本的性能を確認した。しかしながら、分析対象の評価指標である、拡散係数や粒子サイズ、凝集体の構造パラメーターのフラクタル次元に関して正確な評価を行えるまでには至っていない。開発分析装置で正確な前方光散乱の計測が行えるように、光学系の十分な調整が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質凝集の評価指標となる凝集体のフラクタル次元や拡散係数などを正確に評価するために、開発分析装置で正確なF-SLSとF-DLSを同時計測できるように装置光学系の調整を行う。集光照射のF-SLS計測から測定凝集体の正確なフラクタル次元を評価できるように、光学シミュレーションと対比させて解析する。また、CMOSカメラ撮影の画像からF-SLSとF-DLSを抽出処理する方法を構築する。
タンパク質溶液サンプルの温度制御機構、及び顕微分析用の位置制御機構を開発装置に追加して、測定溶液の温度制御と顕微分析に適用する分析装置をセットアップする。
前年度に引き続き、分析対象予定のタンパク質の凝集体サンプル、及びタンパク質架橋反応凝集に使用する糖鎖リガンドの作製と評価を行う。
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