2021 Fiscal Year Annual Research Report
Rational Design of Artificial Metalloenzymes toward On-demand Functionalization of C-H Bond
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20H02755
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大洞 光司 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (10631202)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 人工酵素 / 生体触媒 / ヘム / タンパク質 / 物質変換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
有用な物質を生み出す環境調和型の自在な物質変換を実現するために、立体選択的かつ位置選択的に反応に不活性な基質を官能基化する触媒の開発が求められている。本研究では、高活性な金属錯体とタンパク質マトリクスを組み合わせ、高活性かつ高選択性を達成する人工金属酵素を合理的に設計し、有用な人工金属酵素を開発をめざしている。 具体的には、疎水性空孔を有するタンパク質に、高い触媒能を示す活性中心となる金属錯体を挿入し、さらにタンパク質を遺伝子工学的に最適化することで、高活性で、高い立体・位置選択的にC-H結合を官能基化する人工金属酵素をめざす。また反応メカニズムや構造から詳細を明らかにし、設計法を確立する。
前年度に実施した研究では、ミオグロビン、ヘルズゲートグロビン、シトクロムP450、ペルオキシダーゼとポルフィリンの類縁体であるポルフィセンやコロール、テトラデヒドロコリンおよびそれらに電子求引基や供与基を導入した分子の金属錯体をそれぞれ組み合わせた一連の人工金属酵素を得た。本年度は、これらの中で活性の高かった人工金属酵素について、水酸化とアミノ化反応の活性、選択性の向上を目指して変異導入を実施した。変異は活性中心近傍のアミノ酸残基に導入し、得られる人工金属酵素変異体について 触媒活性の評価を実施した。一部の人工金属酵素の変異体は変異導入前のものを超える活性、選択性を示した。特にアミノ化に注目し、ミオグロビンに鉄ポルフィセンを挿入した人工金属酵素が、分子内アミノ化反応に高い触媒活性を示した。さらにその作用機序を解明すべく、速度論的な評価を実施し、予想通り炭素水素結合の活性化が律速段階であることを明らかにした。得られた成果の一部は国内外の学会、学術誌において発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
有用な物質を生み出す環境調和型の自在な物質変換を実現するために、立体選択的かつ位置選択的に反応に不活性な基質を官能基化する触媒の開発が求められている。本研究では、高活性な金属錯体とタンパク質マトリクスを組み合わせ、高活性かつ高選択性を達成する人工金属酵素を合理的に設計し、有用な人工金属酵素を開発をめざしている。 具体的には、疎水性空孔を有するタンパク質に、高い触媒能を示す活性中心となる金属錯体を挿入し、さらにタンパク質を遺伝子工学的に最適化することで、高活性で、高い立体・位置選択的にC-H結合を官能基化する人工金属酵素をめざす。また反応メカニズムや構造から詳細を明らかにし、設計法を確立する。
前年度に実施した実験では、ミオグロビン、ヘルズゲートグロビン、シトクロムP450、ペルオキシダーゼとポルフィリンの類縁体であるポルフィセンやコロール、テトラデヒドロコリンおよびそれらに電子求引基や供与基を導入した分子の金属錯体をそれぞれ組み合わせた一連の人工金属酵素を得た。本年度は、これらの中で活性の高かった人工金属酵素について、アルカン類の水酸化と分子内アミノ化反応の活性、選択性の向上を目指して変異導入を実施した。変異は活性中心近傍のアミノ酸残基に導入し、得られる人工金属酵素変異体について 触媒活性の評価を実施した。一部の人工金属酵素の変異体は変異導入前のものを超える活性、選択性を示した。特にアミノ化に注目し、ミオグロビンに鉄ポルフィセンを挿入した人工金属酵素が、分子内アミノ化反応に高い触媒活性を示した。さらに、速度論的な評価を実施したところ、触媒の寿命ではなく、活性が向上していることが明らかになり、また予想通り炭素水素結合の活性化が律速段階であることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本年度に構築した人工金属酵素の変異体ライブラリーの拡張とそこから得られる設計法の開発を進める。人工金属酵素の構成要素の一つである金属錯体については、前々年度の研究で反応性の高かったポルフィセンの鉄錯体、マンガン錯体等を利用する。タンパク質は、シトクロムP450のアポタンパク質に焦点をあてる。これらは遺伝子組み替え大腸菌により発現可能であり、全自動で精製できるシステムを構築する 。活性中心近傍のアミノ酸残基を中心に変異を天然以外の19種類導入した一重変異体ライブラリーの構築とランダムで変異を導入した多重変異体を調製する。これらに各種ポルフィセン金属錯体を組み合わせ、C-H結合の水酸化やアミノ化、アルキル化の触媒活性を評価する。この際、 触媒活性や選択性などを漏れなく評価する。活性や選択性の評価は生成物の液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーにより実施する 。単純な収率だけでなく、基質の濃度を変えた速度論的な評価も実施し、触媒活性において改善された点を明らかにする。特に、人工酵素の場 合 、活性種の反応性、基質の結合能、触媒の寿命、副反応の抑制など、様々なファクターで触媒活性の向上が見込まれる。網羅的に得られた 触媒活性に関する実験結果と配列パラメーターあるいは構造パラメーターとの相関を見出し、有望な多重変異体の設計を実施する。構造パラメ ーターに関しては、結晶構造解析や分子動力学計算を用いたもの、単純な一次配列やそれから予測される疎水性やアニオン性、カチオン性など の簡単なパラメーターを用いる。これらから合理的設計法を確立し、一般性のある人工酵素の開発につなげる。
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