2021 Fiscal Year Annual Research Report
General approach for analysis and control of the specific PPI using functionally-modified DNA/RNA aptamers
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20H02769
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
井原 敏博 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 教授 (40253489)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝田 陽介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (50632460)
北村 裕介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (80433019)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | アプタマー / アントラセン光二量化 / 発光性希土類錯体 / タンパク質間相互作用 / PPI / 競合反応 / 核酸コンジュゲート |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質間相互作用(PPI)の研究の重要性は広く認識されており、この極めて多様で複雑な研究対象に対応できる汎用の研究法の開発が望まれている。本研究では標的タンパク質に結合して関連するPPIと競合する核酸アプタマーを独自の手法で選択的に取得し、そのアプタマーを用いた標的PPIの新規 a)モニタリング、および b)可逆的制御法を提案する。
モデルタンパクとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いた。GFPは11のβシートからなるバレル構造をとることがわかっているが、1-10と11番目のβシートの間で分断したスプリットGFP（それぞれβ1-10、β11）をPPIのモデルとして使用した。すなわち、β1-10/β11の再構成をその蛍光強度によりモニタすることが可能である。
通常のSELEXを行い、β11に結合する数種類のRNAアプタマーを取得することに成功した。また、これまでに幾つかのRNAアプタマーはGFPの再構成を競争的に阻害することを確認することができた。RNAアプタマー末端、および相補的な配列を与えたDNA末端にアントラセン（Ant）を化学修飾し、光照射に伴うアントラセン二量体形成を利用してGFPの再構成（PPI）制御の可能性を検討する。二本鎖末端のアントラセンを光二量化させることで分子間の二本鎖を分子内二本鎖に変換することが可能である。分子内の二本鎖は分子間に比べて著しく安定であるので、標的PPIがアプタマーと競争的に進行する条件下では、PPIを光で制御することができる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初は、β1-10に結合するRNAアプタマーを取得する予定で実験を進めていた。当初は競争反応を利用した汎用性の高い手法により目的のRNAアプタマーを取得しようと考えていた。具体的には、β1-10に結合したRNAの中からβ11によって競争的に解離するRNAのみを選択的に取得する計画であった。β11によってβ1-10から掻き出される（競争的に脱離する）アプタマーはPPIの作用面に結合する可能性が高いと考えられるからである。SELEXによりβ1-10に結合するRNAプールを得たが、複合体にβ11を添加してもRNAはほとんど解離することはなかった。そもそも、ここで使用しているGFPはその分子量が大きくなくβ11とβ1-10のPPIの親和性にRNAを掻き出せるほどの強度がなかったと考えた。そこで、方針を変え、β11に対するアプタマーを取得することにした。β11は分子量が小さいため、これに結合する恐らく全てのアプタマーはそのPPIを阻害すると考えた。SELEXの結果、RNAプールは数種類のシーケンスに収束した。蛍光を観測することで、アプタマーのスプリットGFPの再構成PPIに与える影響を観察したところ、幾つかのRNAは再構成を阻害することが明らかになった。すなわち、これらのRNAはアプタマーとして機能し、β11とβ1-10の再結合を競争的に阻害していることがわかった。
RNAアプタマーの末端にAntを化学修飾するために、当初ははじめに化学合成した短いRNAの末端にAntを化学修飾し、これを酵素合成により得た残りのRNA配列とライゲーションする手法を試みた。酵素の種類、条件等種々の検討を行ったが、RNAのライゲーション効率が低く、目的とする充分量のRNAコンジュゲート（Ant-RApt）を得ることができなかった。そこで、全配列を化学合成して目的とするコンジュゲートを合成することにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.長鎖RNAアプタマーの3'末端へのAntの化学修飾を成功させ必要量のAnt-RAptを得る。Ant-RAptに相補的なDNAの5'末端にAntを修飾したコンジュゲートAnt-DcAptを同様の手法により合成する必要があるが、これは申請者に長年の経験のある反応であるので障害はない。両コンジュゲートの合成はMALDI-TOF MSおよびESI-TOF MSにて確認することができる。
2.Ant-RAptとβ11との結合評価 蛍光偏光解消度、SPR、ITCなどを利用して結合定数を求める。Ant-RApt/Ant-DcApt2本鎖に光照射して得られた複合体に関しても同様に再構成GFP、およびβ11との相互作用を検討する。
3.競争反応の観察 Ant-RApt/β11複合体に対して、Ant-DcAptを添加し、光照射下、および暗所下においてGFPの再構成反応をその蛍光を利用して観察する。両条件における競争反応の進行度合いのコントラストを注意深く観察し、Ant-DcAptとしてどの程度の長さのものを使用すべきかの検討を行う。
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[Journal Article] Detection of cancer cells in whole blood using a dynamic deformable microfilter and a nucleic acid aptamer2021
Author(s)
S. Fukuyama, S. Kumamoto, S. Nagano, S. Hitotsuya, K. Yasuda, Y. Kitamura, M. Iwatsuki, H. Baba, T. Ihara, Y. Nakanishi, Y. Nakashima
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Journal Title
Talanta
Volume: 228
Pages: 122239
DOI
Peer Reviewed
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