2022 Fiscal Year Annual Research Report
General approach for analysis and control of the specific PPI using functionally-modified DNA/RNA aptamers
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20H02769
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
井原 敏博 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 教授 (40253489)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝田 陽介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 准教授 (50632460)
北村 裕介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (80433019)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | RNAアプタマー / タンパク質間相互作用 / PPI |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モデルタンパクとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いた。GFPは11のβシートからなるバレル構造をとることがわかっており、1-10と11番目のβシートの間で分断したスプリットGFP（それぞれβ1-10、β11）をPPIのモデルとして使用した。当初は、β1-10に結合するRNAアプタマーの取得を試みた。β1-10に結合したRNAの中からβ11によって競争的に解離するRNAのみを選択的に取得する計画であった。SELEXによりβ1-10に結合するRNAプールを得たが、複合体にβ11を添加してもRNAはほとんど解離することはなかった。ここで使用しているGFPはその分子量が大きくなくβ11とβ1-10のPPIの親和性にRNAを掻き出せるほどの強度がなかったと考えた。そこで、方針を変え、β11に対するアプタマーを取得することにした。β11は分子量が小さいため、これに結合する恐らく全てのアプタマーはそのPPIを阻害すると考えた。SELEXの結果、RNAプールは数種類のシーケンスに収束した。蛍光を観測することで、アプタマーのスプリットGFPの再構成PPIに与える影響を観察したところ、幾つかのRNAは再構成を阻害することが明らかになった。すなわち、これらのRNAはアプタマーとして機能し、β11とβ1-10の再結合を競争的に阻害していることがわかった。
取得したRNAアプタマーを使用したGFP再構成PPIの阻害を細胞中において検討した。すなわち、アプタマーとβ11およびβ1-10をプラスミドを用いてHEK293Tにコトランスフェクトしてその蛍光強度を観察した。アプタマーのスクランブル配列と比較して取得したうち２種類のアプタマーは再構成GFPからの発光強度を40%以下にまで抑制することが分かった。この阻害効果は可逆的であり、アプタマーの相補鎖を導入することで解除できることを確認することができた。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Small Molecule-based Detection of Non-canonical RNA G-quadruplex Structures That Modulate Protein Translation2022
Author(s)
Y. Katsuda, S. Sato, M. Inoue, H. Tsugawa, T. Kamura, T. Kida, R. Matsumoto, S. Asamitsu, N. Shioda, S. Shiroto, Y. Osawatsu, K. Yatsuduka, Y. Kitamura, M. Hagihara, T. Ihara, M. Uesugi
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Journal Title
Nucleic Acids Res.
Volume: 50
Pages: 8143-8153
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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