2021 Fiscal Year Annual Research Report
Effective fabrication and selective retrieval of hybridomas from among cell populations
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20H02771
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
安川 智之 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (40361167)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 雅登 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (60574796)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 誘電泳動 / 細胞アレイ / ハイブリドーマ / 細胞融合 / 選択回収 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，マイクロウェルアレイ電極を用いた誘電泳動による超高速で簡便な細胞操作技術を基盤とした「迅速で高精度な標的抗体産生B細胞の選択的な細胞アレイ化」，「標的抗体産生ハイブリドーマのハイスループットな識別」，「異種細胞ペアアレイの形成と融合」および「捕捉されたポジティブ細胞の選択回収」の一連の操作を可能とする細胞チップの開発することである．本年度は，この目標を達成するために，「迅速で高精度な標的抗体産生B細胞の選択的な細胞アレイ化」，「標的抗体産生B細胞のハイスループットな識別」，「異種細胞ペアアレイの形成と融合」および「捕捉されたポジティブ細胞の選択回収」に取り組んだ．
マイクロウェルアレイ電極を有するマイクロ流路型デバイスに異なる種類の細胞の混合懸濁液を導入し，特定の細胞のみをウェル内に捕捉することができた．これにより複数種類の細胞混合懸濁液の中から標定細胞以外を排除するネガティブセレクションが可能となった．ウェルに捕捉したハイブリドーマ細胞の抗体産生能の評価を行った．細胞表面に抗原を固定化し分泌されたRSAを捕捉し蛍光ラベルにより抗RSA抗体分泌細胞を識別できた．この識別法により，この後の細胞の回収が容易になった．
個々のウェルに免疫マウスから単離したB細胞とミエローマ細胞を位置制御して配置し，左右不均一な電気パルスを印加することによって高効率な異種細胞融合を達成した．2種類の細胞のウェル内位置を制御した配列には，両細胞懸濁液を順に正の誘電泳動でウェル内に捕捉することにより可能である．また，流路上面を電極とすることにより，ウェル内に左右不均一な電場形成を達成した．
細胞アレイを形成後，ウェル選択的に電場を形成することにより，抗体産生細胞のみをウェル外へと除去することができた．また，抗体産生細胞のみをウェル内にとどめそれ以外を排除することも可能であった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の計画で予定していた4項目のすべてに取り組んだ．「抗体産生B細胞の選択的な細胞アレイ化（項目1）」では，異種類の細胞を含む懸濁液中から標的の細胞のみをウェル内に選択的に捕捉し，それ以外は下流へと排除できた．標的外の細胞の表面抗原に対する抗体を固定化したナノ粒子を細胞に修飾し，正の誘電泳動による捕捉力を低減させている．「抗体産生B細胞の識別（項目2）」では，ウェル内に捕捉した細胞アレイの中から抗体産生ハイブリドーマを識別ができた．ウェル内に捕捉した細胞から分泌される抗RSA抗体をウェル底面に固定化したRSAで捕捉した場合，細胞表面に発現した抗体とウェル底面に固定化した抗原間の結合により捕捉した細胞のウェル外への回収が困難であった．そこで，抗原を細胞表層に固定化し，分泌される抗体を表層に捕捉しラベル化により識別を行った．抗体分泌能を有する細胞から，捕捉を示す蛍光シグナルが得られウェル外への回収も可能であった．「異種細胞ペアアレイの形成と融合（項目3）」では，ウェル下面に2電極，ウェル上面に1電極を配置した3電極構造を採用することにより，融合効率の向上を達成した．3電極を用いることにより，B細胞とミエローマ細胞のウェル内位置制御したアレイ化およびウェル内に左右不均一な電場パルスを形成することによりサイズの異なるB細胞とミエローマ細胞の融合ができた．ウェル内に異種類の細胞のペアを迅速（数分）に形成させ，電気パルス融合させることができた．さらに，3次元に配列した電極アレイを用いた融合効率の向上の可能性を示した．「捕捉細胞の選択回収（項目4）」では，項目1で作製した細胞アレイの中から項目2を用いて抗体産生細胞を識別し，高機能性抗体を産生する細胞を選択的にウェル外へと放出することができた．さらには，抗体産生細胞のみをウェル内に残し，それ以外の細胞を除去することも可能であった．
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| Strategy for Future Research Activity |
「迅速で高精度な標的抗体産生B細胞の選択的な細胞アレイ化」では，マイクロウェルアレイ電極に正の誘電泳動（p-DEP）を利用して，特定の表面抗原を発現した細胞のみを捕捉し濃縮して配列する技術を確立する．非標的細胞群に発現する表面抗原に対する複数種類の抗体を固定化した微粒子を作製し，細胞－微粒子複合体を形成する．ここで，細胞群にp-DEPが，微粒子にn-DEPが作用する周波数の交流電圧を印加し，微粒子の結合していない標的細胞をp-DEPによりマイクロウェル内に捕捉し，複合体を形成した非標的細胞を下流へ排除する．理論計算からp-DEPによる単一細胞捕捉の阻害に必要な微粒子サイズおよび修飾数を見積もり，実験結果と比較しながら高速に選択アレイ化できる条件を探索する．
「標的抗体産生B細胞のハイスループットな識別」では，本年度は，免疫化マウスのB細胞を用いてアレイ化を行い，標的の抗体を産生するB細胞を負の誘電泳動を用いて選択的に回収する．また，不要細胞を排除しウェル内に抗体分泌細胞を残す．このハイブリドーマ細胞を培養しモノクローナル抗体を取得できることを示す．
「異種細胞ペアアレイの形成と融合」では，昨年度，長方形型のマイクロウェルアレイ電極に異種細胞ペアの形成を行い，ウェル内に非対称な電場を与え，細胞ペアの融合を行った．しかし，このウェル構造を用いた電気パルス融合法では，電極エッジ面に接触した細胞の破砕が大きな問題であった．今年度は，ウェル底面に多孔質絶縁膜を配置することにより，細胞と電極エッジ間距離を制御し，細胞を局所的高電場にさらすことなく高効率な融合を行う．
「捕捉されたポジティブ細胞の選択回収」では，項目3で作製したハイブリッド細胞の抗体分泌能を項目2の技術で識別し，昨年度までに開発した細胞の選択回収法を用いて，ハイブリドーマ細胞を迅速，簡便に作製できることを示す．
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