2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development and utilization of the model system of disease cell for quantitative analysis of nucleic acid structures in cells
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20H02864
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
建石 寿枝 甲南大学, 先端生命工学研究所, 准教授 (20593495)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞内環境評価系 / 核酸構造 / 液滴 / 神経変性疾患 / リピートRNA / 熱力学的解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、神経変性疾患細胞内の毒性に関わる液滴中にRNAが含まれることが明らかとなったが、液滴中のRNAの役割は不明である。核酸は、周囲の化学環境に応じて多様な高次構造を形成する。そのため、疾患の進行に伴う細胞内の環境変化が核酸の構造を変化させ、ペプチドとの相互作用を制御し、さらに細胞毒となる液滴（凝集体）の形成を制御している可能性がある。本研究では、下記の研究を段階的に遂行する。
（A）新規の細胞内環境評価系を開発し、細胞内での液滴形成機構を解明する（知る研究）。
（B）核酸構造を制御する人工分子を開発し、液滴の新規制御法の開発する（活用する研究）
上記の研究により、細胞内での液滴形成に関する核酸構造の重要性を提唱し、細胞内の液滴の関わる生体反応の新たな調節機構の解明と、その知見を活用した化学的生体反応制御技術を確立する。
2021年度は、昨年度までの研究で、核酸を含む液滴（および凝集体）の形成にはG四重らせん構造が重要であることが示されたため、細胞内を模倣した環境下において二重らせんから四重らせん構造への構造遷移機構を解明した（RSC Adv., 11, 37205 (2021)）。また、核酸構造変化に応答した遺伝子発現機構として、ウイルスの感染に重要なTMPRSS2や、がん遺伝子（Ｍｙｃなど）中のG四重らせん構造が、転写（Chem. Commun., 58, 38 (2021)）。や複製におよぼす影響（J. Am. Chem. Soc., 143, 16458 (2021)）を解析し、これらの生体反応における溶液環境変化に応答した核酸構造の重要性を明らかにした。さらに、核酸の構造を含む液滴の形成が、がんや神経疾患に及ぼす影響について、最近の研究動向や本研究の重要性を含めた研究成果を総説として発表した（ Nucleic Acids Res., 49, 7839 (2021)）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、神経変性疾患やがん細胞などのイオンチャネルの発現バランスに注目し、イオン濃度やクラウディング分子（中性高分子）濃度を変化させることによって、細胞内環境評価系を構築した。このような環境下で実験を遂行することにより、細胞内の分子環境が、二重らせん構造がｉ－モチーフ四重らせんやＧ四重らせん構造への構造遷移する機構や、Ｇ四重らせん構造のトポロジーに及ぼす周辺環境の重要性を示唆する結果を得ることができた（J. Am. Chem. Soc., 143, 16458 (2021)、 Chem. Commun., 58, 38 (2021)、RSC Adv., 11, 37205 (2021)）。さらに、これらの構造が疾患に関わる転写や複製反応に及ぼす影響を物理化学的に解析し、核酸の構造変化に応じた反応効率の変化が誘起されることを定量的に明らかにした（J. Am. Chem. Soc., 143, 16458 (2021)、 Chem. Commun., 58, 38 (2021)）。また、神経変性疾患に関わるRNA構造とペプチドの相互作用が転写に及ぼす影響を解析する研究に着手し（ Nucleic Acids Res., 49, 7839 (2021)）、核酸構造が、細胞の毒性や遺伝子発現阻害に関わる影響を明らかにできつつある。そのため、本研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、ALS/FTD患者の細胞内で細胞毒の原因となるペプチド（poly-GA, poly-GPペプチド）、ハンチントン病などに関わるr(CAG)リピートおよびpoly-Qペプチドなどの10種類のRNA配列とペプチドの相互作用を分光光度計による懸濁率測定、ダイナミック光散乱高度計、等温滴定型カロリメトリー、分子動力学計算等によって解析する。またSHELL内においても凝集体の形成を、凝集体に特異的に結合する蛍光ブローブ(チオフラビンT)によって視覚化し、顕微鏡にて解析する。
さらに、試験管内で重要であることが予想された相互作用が、細胞内でも重要か否かについて解析を行う。まずモデル細胞として、マウスの正常細胞（NIH3T3）や、カリウムイオンの濃度が異なると推察されるMCF-10A, MCF-7、MDA-MB-231、および細胞内のカリウムの放出を司るカリウムチャンネル（KCNH1）の発現をノックダウンした細胞株を用いて、細胞内のイオン濃度変化に応じた核酸の構造や液滴形成を解析する。構造体の形成は共焦点レーザー顕微鏡や、蛍光プレートリーダで行う。また、細胞内と試験管内の結果の相関を見積もり、溶液のどの物理化学的パラメータ（イオン強度、水や溶質の活量、誘電率、粘性、表面張力など）が四重鎖の安定性を決定する因子であるかを考察する。
さらに、試験内で液滴構造および凝集体を形成させ、イオンや人工核酸を添加し、これらの構造の解離、形成を制御することを試みる。また、イオン濃度の異なる細胞株や、神経疾患の初代細胞内でも液滴構造および凝集体構造を形成させ、イオン等の刺激により構造制御を試みる。
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[Journal Article] Chemical Modulation of DNA Replication along G-Quadruplex Based on Topology-Dependent Ligand Binding2021
Author(s)
S. Takahashi, A. Kotar, H. Tateishi-Karimata, S. Bhowmik, Z.-F. Wang, T.-C. Chang, S, Sato, S. Takenaka, J. Plavec, and N. Sugimoto
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Journal Title
J. Am. Chem. Soc.
Volume: 143
Pages: 16458-16469
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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