2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a novel genome editing method through transient arrest control of the tumor suppressor protein p53
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20H02873
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
坂口 和靖 北海道大学, 理学研究院, 教授 (00315053)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鎌田 瑠泉 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (40750881)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 癌抑制タンパク質p53 / 多量体形成 / ゲノム編集 / ペプチド / 一過的阻害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集は、次世代の遺伝子治療法として大きな注目を集めている。しかしながら、CRISPR/Cas9においても、がん抑制タンパク質p53が変異・欠損している細胞に対して優先的にゲノム編集が起こり、治療後の細胞癌化の副作用の恐れがある。このため、有効な治療法が遺伝子治療のみである遺伝性疾患等の治療のために、より安全なゲノム編集法の開発が求められている。安全なゲノム編集のためには、細胞癌化の抑制機構経路の中心であるp53機能を『一過的』に停止制御することが必須である。本研究では、癌抑制タンパク質p53機能の時間的制御による新規ゲノム編集法の開発研究を実施する。すなわち、p53の機能発現に必須な四量体形成を介して、ゲノム編集するときのみp53活性を停止させ、効率的なゲノム編集を達成し、編集後にp53活性を回復させることにより細胞癌化を抑止可能な安全なゲノム編集法の開発を目指す。
初年度は、癌抑制タンパク質p53ヘテロオリゴマー形成を基盤とした一過的にp53の機能を阻害する新規ペプチドID-p53Tetをデザインし、大腸菌発現系による発現精製の検討および化学合成を実施した。また、ゲノム編集に用いるCas9タンパク質（SpCas9およびCjCas9）の発現系を確立した。さらに、コイルドコイル（CC）ペプチドを用いた機能性ペプチドの多量体化を実施し、エンドサイトーシス促進ペプチドL17Eの二量体化および三量体化がその生理活性に及ぼす効果を解析した。L17Eペプチドの多量体により、タンパク質やプラスミドの細胞導入効率が大きく変化することを明らかとした。
本研究における、多量体化を基盤とした新規機能性ペプチドの創成および癌抑制タンパク質p53のヘテロオリゴマー化を介した一過的機能阻害ペプチドID-p53Tetの開発により、安全かつ効率的なゲノム編集法の開発が強く期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、新型コロナウイルス感染症の蔓延による、担当教員および大学院生の活動制限のため、以下の実験を新規に計画した。多量体化が機能性分子の機能に及ぼす効果を解析するため、ホモ二量体および三量体を形成するコイルドコイル（CC）ペプチドを用いた機能性ペプチド多量体化効果の系統的解析を実施した。三次元分子素子として酵母転写活性化因子配列由来の単量体CC(mono)、二量体CC(Di)、三量体CC(Tri)を選択した。機能性ペプチドとして、エンドサイトーシス促進ペプチドL17Eを選択し、コイルドコイルのN末端部位に融合したペプチドをFmoc固相法により化学合成し、その構造および生理活性を解析した。合成したCC(Di)およびCC(Tri)はコイルドコイル構造を形成している一方、CC(mono)はランダムコイル様のスペクトルを示し、単量体であることが示された。続いて、エンドサイトーシス活性を持つペプチドの多量体化によりプラスミドの細胞導入効率が変化することを見出した
さらに、癌抑制タンパク質p53ヘテロオリゴマー形成を基盤とした一過的にp53の機能を阻害する新規ペプチドID-p53Tetの大腸菌発現系による発現精製を検討した。p53TetのN末端にエンドサイトーシス、エンドソーム脱出、および核局在配列を融合させたものをデザインし、大腸菌発現用プラスミドをクローニングした。しかしながら、種々の条件においてもこのペプチドは大腸菌発現系による発現精製が困難であった。このため、Fmoc固相合成法により化学合成を実施した。また、Streptococcus pyogenes由来のCas9（SpCas9）およびCampylobacter jejuni由来のコンパクトなCjCas9の大腸菌発現系を確立し、ゲノム編集に用いるタンパク質を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）初年度に引き続き、各種機能性ペプチドの多量体化がその生理活性に及ぼす効果を解析する。機能性ペプチドとして、抗菌活性ペプチドの多量体化についても検討する。
（２）癌抑制タンパク質p53ヘテロオリゴマー形成を基盤とした一過的にp53の機能を阻害する新規ペプチドID-p53Tetの機能解析を実施する。p53活性をシングルセルでモニターするレポーター系を確立し、合成したID-p53Tetのp53機能阻害活性を評価する。さらに、Cas9および改良型タンパク質とともに細胞に投与、導入してそのゲノム編集効率を解析する。これにより、p53機能がゲノム編集効率に及ぼす効果を明らかとする。
（３）上記の結果をフィードバックし、p53機能の時間的制御によるゲノム編集効率の高いID-p53Tetの最適化を実施する。
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