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2021 Fiscal Year Annual Research Report

Development of a novel genome editing method through transient arrest control of the tumor suppressor protein p53

Research Project

Project/Area Number 20H02873
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

坂口 和靖  北海道大学, 理学研究院, 教授 (00315053)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 鎌田 瑠泉  北海道大学, 理学研究院, 准教授 (40750881)
Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords癌抑制タンパク質p53 / 多量体形成 / ゲノム編集 / ペプチド / 一過的阻害
Outline of Annual Research Achievements

ゲノム編集は、次世代の遺伝子治療法として大きな注目を集めている。しかしながら、CRISPR/Cas9においても、癌抑制タンパク質p53が変異・欠損している細胞に対して優先的にゲノム編集が起こり、治療後に細胞癌化の副作用の恐れがある。このため、有効な治療法が遺伝子治療のみである遺伝性疾患等の治療のために、より安全なゲノム編集法の開発が求められている。安全なゲノム編集のためには、細胞癌化の抑制機構経路の中心であるp53機能を『一過的』に停止制御することが必須である。本研究では、癌抑制タンパク質p53機能の時間的制御による新規ゲノム編集法の開発研究を実施する。すなわち、p53の機能発現に必須な四量体形成を介して、ゲノム編集するときのみp53活性を停止させ、効率的なゲノム編集を達成し、編集後にp53活性を回復させることにより細胞癌化を抑止可能な安全なゲノム編集法の開発を目指す。
初年度は、コイルドコイルペプチドによる機能性ペプチドの多量体化がその生理活性に及ぼす効果を制御することを見出した。今年度は、機能性ペプチドとして我々が発見した抗菌活性ペプチドr-Pep1を用い、その多量体化により大腸菌および哺乳細胞の増殖に対する効果を顕著に変化させることを見出した。さらに、一過的にp53の機能を阻害した際のゲノム編集効率を解析するため、ID-p53Tetペプチドの機能解析のためのp53活性およびゲノム編集効率を同時にモニターするレポーター系を確立した。
本研究における、多量体化を基盤とした新規機能性ペプチドの創成および癌抑制タンパク質p53のヘテロオリゴマー化を介した一過的機能阻害ペプチドID-p53Tetの開発により、安全かつ効率的なゲノム編集法の開発が強く期待される。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は、引き続きペプチド多量体化が機能性分子の生理活性に及ぼす効果を解析した。機能性ペプチドとして我々が見出した新規抗菌活性ペプチドr-Pep1を選択し、コイルドコイルのN末端部位に融合したペプチドをFmoc固相法により化学合成した。抗菌活性ペプチドr-Pep1のCC(Di)およびCC(Tri)による多量体化により大腸菌および哺乳細胞の増殖に対する生理活性が顕著に変化することを示した。
また、癌抑制タンパク質p53ヘテロオリゴマー形成を基盤とした一過的にp53の機能を阻害する新規ペプチドID-p53Tetの更なる改良を実施し、その機能解析のための系を確立した。デザインしたID-p53TetペプチドとCas9タンパク質を同時に細胞内に導入し、ゲノム編集効率を向上させるため、両者が特異的に結合するようにコイルドコイルフラグメントを融合させた新規ID-p53Tetおよび修飾Cas9をデザインし、それぞれの大腸菌発現用プラスミドをクローニングした。
さらに、ゲノム編集効率およびp53転写活性を同時に解析する蛍光レポーターアッセイ系を確立した。野生型p53を発現するA549細胞を用い、異なる2つのp53 Responsive element由来のp53の転写活性をCeruleanおよびVenus蛍光によりモニターし、さらにはmCherryをターゲットとしたgRNAを用いてCas9によるゲノム編集が起こると蛍光タンパク質mCherryの発現が失われるレポーター系を構築した。

Strategy for Future Research Activity

(1)2020年度・2021年度に引き続いて、各種機能ドメインをp53Tetまたは二量体・三量体コイルドコイルを用いて多量体化したペプチドをデザイン・合成し、これら多量体化ペプチドの機能を解析することで、機能性ペプチドの多量体化が生理活性に及ぼす効果を明らかとする。
(2)癌抑制タンパク質p53ヘテロオリゴマー形成を基盤とした一過的にp53の機能を停止する新規ペプチドID-p53Tetおよび確立したレポーター系を用いて、内因性p53機能の一過的阻害効果を解析する。さらに、ID-p53TetおよびCas9またはCjCas9とともに細胞に導入し、ゲノム編集効率を解析する。これにより、p53機能がゲノム編集効率に及ぼす効果を明らかとする。
(3)上記の結果をフィードバックし、p53機能の一過的制御によるゲノム編集効率の高いID-p53Tetの最適化を実施することにより、安全性の高いゲノム編集法の開発を目指す。

  • Research Products

    (15 results)

All 2022 2021

All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 5 results)

  • [Journal Article] Role of active site arginine residues in substrate recognition by PPM1A2021

    • Author(s)
      Itsumi Tani, Shogo Ito, Yukiko Shirahata, Yutaka Matsuyama, James G Omichinski, Yasuyuki Shimohigashi, Rui Kamada, Kazuyasu Sakaguchi
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 581 Pages: 1-5

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2021.10.001

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] PPM1D is a Therapeutic Target in Childhood Neural Tumors2021

    • Author(s)
      Jelena Milosevic, Diana Treis, Susanne Fransson, Gabriel Gallo-Oller, Baldur Sveinbjornsson B, Nina Eissler, Keiji Tanino, Kazuyasu Sakaguchi, Tommy Martinsson, Malin Wickstrom, Per Kogner, John Inge Johnsen
    • Journal Title

      Cancers

      Volume: 13 Pages: 6042-6062

    • DOI

      10.3390/cancers13236042

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] がんおよび免疫制御関連タンパク質の構造と機能に関する化学的研究2022

    • Author(s)
      鎌田瑠泉
    • Organizer
      日本化学会第102春季年会(2022)
    • Invited
  • [Presentation] Interaction of Arginine Residues with phosphate group in the Active Site of Ser/Thr Phosphatase PPM1A2021

    • Author(s)
      Shogo Ito, Itsumi Tani, Yukiko Shirahata, Yasuyuki Shimohigashi, Rui Kamada, Kazuyasu Sakaguchi
    • Organizer
      35th Anniversary Symposium of The Protein Society
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Effect of Phosphorylation of Nucleolar Protein Nucleophosmin on Nucleolar Formation2021

    • Author(s)
      Itsumi Tani, Shogo Ito, Yui Oikawa, Rui Kamada, Kazuyasu Sakaguchi
    • Organizer
      35th Anniversary Symposium of The Protein Society
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Alterations in the stability and hetero-oligomerization of the p53 family in vertebrates2021

    • Author(s)
      Shuya Sakaguchi, Natsumi Nakagawa, Haytham Wahba, Rui Kamada, James G. Omichinski, Kazuyasu Sakaguchi
    • Organizer
      35th Anniversary Symposium of The Protein Society
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 核小体タンパク質Nucleophosminのリン酸化による核小体形成制御機構の解明2021

    • Author(s)
      谷愛海、伊藤祥吾、及川ゆい、鎌田瑠泉、坂口和靖
    • Organizer
      第58回日本生化学会北海道支部例会
  • [Presentation] 脊椎動物における癌抑制タンパク質p53とp53ファミリーの四量体構造の進化2021

    • Author(s)
      坂口周弥、中川夏美、鎌田瑠泉、James G. Omichinski、坂口和靖
    • Organizer
      第58回日本生化学会北海道支部例会
  • [Presentation] 細胞分化におけるSer/ThrホスファターゼPPM1Dの新規機能の解明2021

    • Author(s)
      鎌田瑠泉
    • Organizer
      生体機能関連化学部会 若手の会第32回サマースクール
    • Invited
  • [Presentation] コイルドコイルを介したペプチドの多量体化による生理活性増強効果2021

    • Author(s)
      布川優奈、坂口周弥、碓井拓哉、鎌田瑠泉、坂口和靖
    • Organizer
      日本化学会北海道支部2021年夏季研究発表会
  • [Presentation] 好中球セブセットの分極化におけるSer/Thrホスファターゼ PPM1Dの機能解明2021

    • Author(s)
      鎌田瑠泉
    • Organizer
      第7回北海道大学部局横断シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] Anti-antibiotic activity of r-Pep2 derived from putative ORF sequence in E.coli rRNA2021

    • Author(s)
      Yuma Omata, Junya Imaizumi, Rui Kamada, Kazuyasu Sakaguchi
    • Organizer
      第58回ペプチド討論会
    • Invited
  • [Presentation] Prmt5 methylates tumor suppressor protein p53 to regulate the stability of tetramer2021

    • Author(s)
      Natsumi Nakagawa, Shuya Sakaguchi, Junya Wada, Rui Kamada, Kazuyasu Sakaguchi
    • Organizer
      第58回ペプチド討論会
  • [Presentation] Analysis of oligomerized bioactive peptides for eukaryotic and prokaryotic cells2021

    • Author(s)
      Yuna Nunokawa, Shuya Sakaguchi, Rui Kamada, Kazuyasu Sakaguchi
    • Organizer
      第58回ペプチド討論会
  • [Presentation] Ser/Thr ホスファターゼPPM1D による好中球サブタイプの多様性制御2021

    • Author(s)
      鎌田瑠泉
    • Organizer
      第94回日本生化学会大会
    • Invited

URL: 

Published: 2022-12-28  

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