2020 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内共生成立後の宿主による根粒菌選別機構の解明と土壌根粒菌叢への影響の評価
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20H02884
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
佐藤 修正 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (70370921)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 宿主-根粒菌相互作用 / 窒素固定活性 / Cheating根粒菌 / 宿主制裁機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
宿主によるCheating根粒菌（感染能力を持つが窒素固定を行わない根粒菌）への制裁機能の欠失変異体（pink4変異体）を用いて、圃場から4種類のCheating根粒菌株（w4、 S24、 S33、S35）を単離した。これらの菌株をpink4変異体とその親株のMG-20系統に接種した結果、S24株では両系統ともに白色の無効根粒が形成され、w4株S35株ではMG-20系統で無効根粒が、pink4で有効根粒が形成され、S33株では両系統ともに有効根粒が形成されるという予備実験の結果が再現された。窒素固定活性の測定を行なった結果、S24株、 w4株では窒素固定活性が検出されず、S33株、S35株では標準株と比べて低いレベルの窒素固定活性が検出された。このように、宿主反応、窒素固定活性において多様な宿主―根粒菌株の組み合わせが確認できたので、当初計画通りこれらのトランスクリプトーム解析を実施した。
4種類のCheating根粒菌株のゲノム配列解析を行い、4株全てで配列を確定することができた。得られたゲノム情報から、w4株のCheating菌化の原因がrpoN2遺伝子のナンセンス変異であることを同定した。また、S33株はAminobactor属のゲノムにミヤコグサ根粒菌の共生アイランドが挿入された株であることが明らかとなり、これが窒素固定活性が低い原因であると推定された。
日本各地から単離されたミヤコグサ根粒菌とミヤコグサ野生系統の組み合わせでの窒素固定活性の評価を行なった結果、2種類の菌株（113株と131株）の間で、宿主系統間での窒素固定活性の変動パターンの差が大きいことを見出した。これらの菌株を用いれば窒素固定活性の宿主系統間差を指標とした解析も可能なレベルと判断されたため、当初計画を発展させ窒素固定活性の差を生じさせる宿主遺伝子座の解析も視野に入れた研究を行うこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度開始時はコロナウイルス禍の影響で、各課題の実験計画が3～4ヶ月遅れて進行する状況となったが、制限の解除後に、ファイトトロンや人工気象器のスペースを通常より多く確保することにより、課題1と3で必要な接種実験を拡大して実施し、年度末の段階でほぼ当初計画の通りにもどすことができた。
課題1では、圃場単離のCheating菌を用いた接種実験で、予備実験で検出していた菌株間の表現型の差を再現することができた。さらに、窒素固定活性の測定により表現型の差を裏付ける結果も得られたことから、窒素固定活性に応じた宿主の遺伝子発現変動の解析に適した材料が準備できたと考えている。これらの材料を用いたRNA-seq解析も委託業者の協力を得て年度内にデータを得ることができた。
課題2では、圃場単離のCheating菌株のゲノム配列解析を実施した。配列解析をロングリードシーケンサーを用いて行なったため、アセンブルもスムーズに行うことができ、4株全てで配列を確定することができた。先行して解析を行ったw4株については、rpoN2遺伝子の変異がCheating菌化の原因であることを明らかにした。また、遅れて解析を行ったS24、 S33、 S35株についても、S33株が他の菌株と属レベル異なるAminobactor属の菌であることが判明し、これが窒素固定活性低下の原因である可能性が示唆された。
課題3では、異なる採取地で単離された根粒菌と宿主系統との組み合わせでの窒素固定活性の評価を実施した。コロナ禍での進捗遅れの影響で、菌の選抜が当初予定よりも大幅に遅れることとなったが、2種類の菌株（113株と131株）の間で、予備実験から想定したよりも大きな窒素固定活性の変動パターンの差が得られることが明らかとなり、この2種の菌株に集中して解析を進めることで当初計画を発展させた解析も可能となると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題１については、当初計画通り2020年度で窒素固定活性レベルの異なる根粒菌と宿主（PINK4遺伝子の活性あり、なし）の組み合わせでのRNA-seqデータを得ることができたので、今年度以降このデータ解析を中心に展開し、既存データと合わせた共発現解析等のアプローチにより宿主で起こっている反応に関わる遺伝子群を同定する。加えて、宿主反応によるCheating菌の動態を解析する目的で、解析に使用している4種のCheating菌株の蛍光(DsRed)標識株を作製し、宿主反応を考察するための追加実験を実施する。
課題２については、2020年度に解読したゲノム情報を基に根粒菌の比較ゲノム解析を展開する。S24、 S35株については、Cheating菌化の原因遺伝子の同定を行うとともに、圃場単離の根粒菌の中で窒素固定活性を持つものについてゲノム配列解析を行い、課題３の圃場における菌叢解析においてこれらの菌株間の比較が可能となるゲノム領域を選定する。合わせて宿主系統との組み合わせでの窒素固定活性を評価し、圃場での菌叢解析の基盤情報を構築する。
課題3については、2020年度の解析で、宿主系統との組み合わせによる窒素固定活性の変動パターンの差が大きい2種類の菌株（113株と131株）が得られたことから、当初計画を一部変更し、これらの菌株の間の窒素固定活性の差について宿主系統の網羅的な解析を行うこととし、そのデータを基にこの差をもたらす宿主のゲノム領域の解析を実施する。これと並行して、113株と131株のゲノム配列を比較し、それぞれの菌株に得意的なゲノム領域を対象としたqPCRを実施する。これにより、計画していたポット栽培による競合接種実験の菌叢解析を蛍光標識のためのゲノム改変を回避して実施することが可能となり、人為的なバイアスを考慮することなく菌叢への影響を評価できる系の確立を目指す。
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[Presentation] ミヤコグサ関連リソースの最新状況とその応用2021
Author(s)
佐藤 修正, , Yusdar Mustamin, Madihah Manggabarani, 番場 大, Turgut Akyol, Stig Andersen, Nadia Kamal, Klaus Mayer, 橋口 正嗣, 田中 秀典, 明石 良
Organizer
第62回日本植物生理学会
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