2021 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanism of hyphal aggregation evoked by cell-surface polysaccharides in filamentous fungi.
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20H02895
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
阿部 敬悦 東北大学, 農学研究科, 教授 (50312624)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 界面活性タンパク質 / 自己組織化 / 糸状菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は糸状菌細胞壁の不溶性多糖α-1,3-グルカン（AG）と水溶性ガラクトサミノガラクタン（GAG）が菌糸接着因子であることを発見した。しかし、菌糸接着を制御するAG及びGAG糖鎖の化学的特性と糖鎖間の相互作用の関係性は不明である。本研究では、分子量の異なるAG及び分子量と電荷の異なるGAGを発現する株を用いて菌糸接着能を評価すると共に、各株より精製した糖鎖を用いた糖鎖間の相互作用をin vitroで定量解析し、菌糸接着の分子機構の統合的理解を図る。
1)AG合成関連遺伝子改変株のAG分子量の決定と各株の菌糸接着能を測定する。(阿部,吉見[研究支援者])～A. nidulans amyD遺伝子高発現株のAG分子量は、野生型株のAG分子量より小さいことを明らかにした。AgtAのGPIアンカー削除変異体（AmyDΔGPI）発現株では、AmyDΔGPIが菌対外に分泌されAG分子量が低下しないことから、AmyDが細胞壁で機能することを示した。野生型株に比較して、amyD高発現株ではAG量が1/3以下で分子量も低下して菌糸が分散した。AmyDホモログの麹菌AgtAをピキア酵母で発現精製し、酵素学的解析を行った結果、AG中のスペーサーα-1,4結合を切断し、分子量低下に寄与する推論された。麹菌agtAをA. nidulansで発現すると、AG分子量が低下した。
2)AG合成関連遺伝子改変株から精製したAGを結合した微粒子を作製し、その粒子を用いたAG糖鎖間、AG-GAG糖鎖間の相互作用を定量化する。(阿部)～AG吸着粒子の選定と吸着条件の探索を行って、ODS粒子を選択した。
3)GAG合成関連遺伝子改変株から精製したGAGを結合した微粒子を作製し、その微粒子を用いてGAG糖鎖間、GAG-AG糖鎖間の相互作用を定量化する。(阿部)～2)の実験に手間取り、GAGの分離精製に実験が留まった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1)AG合成機構に関する解析は、AG合成関連遺伝子の高発現変異体、遺伝子破壊株のAG分子量解析、菌糸先着解析を中心に順調に進展している。特にGPIアンカー型のα-アミラーゼ A. nidulans AmyD及びそのホモログである久慈欽菌AgtAがAG中のスペーサーであるα-1,4 結合をendo型に切断することで分子量を制御することを示し、論文出版に至った。
2)精製AGおよびGAGを被覆した粒子による糖鎖相互作用の研究に関しては、AG吸着用の粒子選択と吸着条件の探索に手間取ったが最終的にODS粒子の選択に至った。そのためGAG粒子の製作は遅れているがGAG精製法は確立している。
3)一方で、細胞膜画分を用いたAG生合成のin vitro解析系の構築を試みてきたが、多数の条件を検討したにも拘らず有意な活性検出に至らなかった。この項目に関しては、中止し１）、２）に集中する。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)AG合成関連遺伝子改変株のAG分子量の決定と各株の菌糸接着能を測定する。(阿部,吉見[研究支援者])～A. nidulansのAgsB/AgsA変異体を用いたAG分子量解析によるAG合成機構の解析を行う。AgtA/AnyD変異体を用いたAG分子量解析によるAG分子量制御機構の解析を行う。これらの結果を統合して、AG合成機構と菌糸接着の関係を統合的に理解する。
2)AG合成関連遺伝子改変株から精製したAGを結合した微粒子を作製し、その粒子を用いたAG糖鎖間、AG-GAG糖鎖間の相互作用を定量化する。(阿部)～分子量の異なるAGを被覆したODS粒子を用いて、粒子凝集を定量化し、AG分子量とAG糖鎖、AG-GAG糖鎖の相互作用の関係を明らかにする。
3)GAG合成関連遺伝子改変株から精製したGAGを結合した微粒子を作製し、その微粒子を用いてGAG糖鎖間、GAG-AG糖鎖間の相互作用を定量化する。(阿部)～分子量・電荷の異なるGAGをイオン交換粒子に吸着させて、GAG被覆粒子の凝集及びGAG被覆粒子とAG被覆粒子の凝集を定量化する。その結果から、GAG分子量・電荷と糖鎖間の相互作用の関係を明らかにする。
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[Journal Article] A glycosylphosphatidylinositol-anchored α-amylase encoded by amyD contributes to a decrease in the molecular mass of cell wall α-1,3-glucan in Aspergillus nidulans.2022
Author(s)
Miyazawa K., Yamashita T., Takeuchi A., Kamachi Y., Yoshimi A., Tashiro Y., Ami Koizumi A., Ogata M., Yano Y., Kasahara S., Sano M., Yamagata Y., Nakajima T., and Abe K.*
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Journal Title
Frontiers in Fungal Biol.
Volume: 2
Pages: 821946
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Improved recombinant protein production in Aspergillus oryzae lacking both α-1,3-glucan and galactosaminogalactan in batch culture with a lab-scale bioreactor.2021
Author(s)
Ichikawa H., Miyazawa K., Komeiji K., Susukida S., Zhang S., Mutto K., Orita R., Takeuchi A., Kamachi Y., Hitosugi M., Yoshimi Y., Shintani T., Kato Y., Abe K.*
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Journal Title
J. Biosci. Bioeng.
Volume: 133
Pages: 39-45
DOI
Peer Reviewed
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