2020 Fiscal Year Annual Research Report
Creation of microbial cells as the innovative chassis for isoprenoid production
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20H02899
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
邊見 久 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (60302189)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
海野 英昭 長崎大学, 工学研究科, 准教授 (10452872)
伊藤 智和 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (90584970)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | メバロン酸経路 / 古細菌 / イソプレノイド / 大腸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
古細菌および未培養真正細菌より単離した、古細菌型メバロン酸経路を構成する新奇酵素であるホスホメバロン酸脱水酵素（PMDh）およびホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素（AMPD）の酵素学的な解析を進め、いくつかの新たな知見を得た。一例として、真正細菌由来のAMPDが活性を発揮するには、補酵素であるプレニル化FMN（prFMN）による再構成が必要であるが、一般的な古細菌のAMPDが再構成にマンガンイオンを要求するのに対し、真正細菌由来のAMPDはマンガンイオンでは再構成されず、鉄イオンを要求するという特性が見出された。PMDhに関しては、いずれの生物種に由来する酵素であっても酸素存在下ですぐに失活し、応用目的において有利な酸素耐性の高い同酵素を得るには何らかの工夫が必要であると思われた。我々は、同酵素の活性中心に4Fe-4Sクラスターが存在することをEPR解析によって明らかにしており、その酸素感受性がPMDh失活の原因だと推察される。
それらの新奇酵素を含む、古細菌型メバロン酸経路を構成する酵素群を大腸菌に導入し、揮発性テルペン化合物の大量生産系の構築を目指した。大腸菌を嫌気培養した際には、同経路の導入によって明らかにテルペン生産は向上し、ポジティブコントロールに用いた真核生物型メバロン酸経路導入株に匹敵する生産性が観察された。しかし、文献値と比較して明らかにテルペン生産量が低かったため、テルペン生合成系の酵素発現を最適化する必要性があると考えられた。
また、メタン生成古細菌をモデルとし、prFMNの生合成を触媒するprFMN合成酵素と、同酵素にプレニルドナー基質であるジメチルアリルリン酸を供給するNudix hydrolaseを見出し、古細菌型メバロン酸経路の周辺で機能する補酵素の代謝経路とそれに関連する酵素群を同定できたことも成果の１つである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
古細菌型メバロン酸経路の導入により、革新的なイソプレノイド生産のシャーシとなりうる微生物を作製するという最終的な目標については、メバロン酸経路の発現強化によって宿主である大腸菌の生育が悪化するといった現象が起き、今後対応すべき点が多く、現状では目標を達成できているとは言えない。その一方で、古細菌型メバロン酸経路中の新奇酵素の特性評価や、同経路周辺の新奇代謝酵素の発見など、酵素学的な研究は順調に進んでおり、代謝工学的な応用に不可欠な多くの知見が蓄積されつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
古細菌型メバロン酸経路を構成する、ホスホメバロ ン酸脱水酵素(PMDh)とホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素(AMPD)という２つの新奇酵素について、反応機構解析とX線結晶構造解析を進める。特に、PMDhの酸素感受性の原因を明らかにし、今後の同経路の応用に活かしていくために、酸素に耐性を示す同酵素を進化分子工学的な手法により作出することを目指す。酸素耐性PMDhの単離には、カロテノイド色素の生産を指標としたコロニースクリーニング系を用いることを予定している。また、AMPDの補酵素であるプレニル化フラビンモノヌクレオチド(prFMN)を合成するprFMN合成酵素について、AMPDとのタンパク質間相互作用などの興味深い性質が明らかにされている。そこでAMPDの活性化機構を検証し、同機構におけるprFMN合成酵素の役割を解明する。
本研究課題の最終目的である古細菌型メバロン酸経路を利用したテルペン化合物の高効率な微生物生産については、古細菌型メバロン酸経路が酸素感受性であることと、テルペン生合成酵素が同システムのボトルネックになっていることが問題点として予想されている。前者については酸素耐性酵素の探索もしくは作出による改善を目指す。後者については、プロモーターの変更などの手段により問題点を改善し、古細菌型メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の効率を正確に評価するとともに、既知の真核生物型メバロン酸経路との比較を行いたい。
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