Molecular basis of ancestral sulfur relay system

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H02901
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 秀瀬 涼太 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命准教授 (90610866)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鴫 直樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20392623) ; 大平 高之 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (90727520)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: アーキア / 硫黄転移 / ユビキチン様タンパク質 / モリブドプテリン / tRNAチオヌクレオチド

Outline of Annual Research Achievements

超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisはユビキチン様タンパク質（TK1065, TK1093, TK2118）を持つ。大腸菌などバクテリアのモリブドプテリン生合成では、ユビキチン様タンパク質のC末端GGモチーフの末端グリシンのカルボキシル基がATP依存的モリブドプテリン合成酵素アデニルイル基転移酵素によってAMP化され、その後、硫黄転移酵素によって硫黄原子が付加してcarbothioic S-acidとなることが知られている。TK2118遺伝子は、ATP依存的モリブドプテリン合成酵素アデニルイル基転移酵素と相同なTK2117遺伝子とオペロンを形成している。2021年度は、特にTK2118のチオカルボキシル化に着目して、TK2117とTK2118の機能解析を行い以下の知見を得た。1. TK2117のATP加水分解活性をATPの加水分解によって生じるリン酸を定量して測定したところ、TK2117単独での活性と比べて、TK2118を添加することでTK2117のATP加水分解活性が向上した。これは、TK2118によってTK2117のATP加水分解活性が促されたことを示唆する。2. TK2117のATP加水分解活性によって生じるAMP化TK2118を解析するために、TK2117とTK2118混合物またはATP存在下でのTK2117-TK2118反応物を調製し、質量分析を行った。この結果、反応物でのみTK2118の質量の増大が見られたことから、AMPを含む化合物がTK2118分子に付加しているものと考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでの研究で、T. kodakarensisのモリブドプテリン生合成に関しては、ユビキチン様タンパク質の欠損によってモリブドプテリン含有酵素(アルデヒド:フェレドキシン酸化還元酵素など)の活性が減少することがわかっている。しかしながら、モリブドプテリン含有酵素活性の減少が補因子生合成不全もしくはタンパク質合成不全によるものか明らかでない。この直接的関与は、ユビキチン様タンパク質がモリブドプテリン生合成に関わるかどうかの根幹に関わることで、未だにその証明に至っていないことから総合的には「やや遅れている。」と評価することが妥当と考えられる。

Strategy for Future Research Activity

T. kodakarensis野生株やユビキチン様タンパク質の欠損株からモリブドプテリンを抽出し、LC-MSにて分析することで、含量比較を行う。ATP依存的モリブドプテリン合成酵素アデニルイル基転移酵素TK2117のATP加水分解活性について、TK2118以外のユビキチン様タンパク質（TK1065、TK1093）の添加による影響を調べる。T. kodakarensis細胞を硫黄の安定同位体（34S）を含む培地で培養し、34Sで標識されたモリブドプテリンやtRNAチオヌクレオチドをLC-MS/MSで解析する。