菌根共生を制御するKAI2受容体リガンドの同定とその共生制御機構の解明

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H02925
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 秋山 康紀 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (20285307)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: KAI2リガンド / カリキン / ストリゴラクトン / ミヤコグサ

Outline of Annual Research Achievements

KAI2 ligand (KL) と呼ばれる未知の内生ホルモンは、KAI2受容体を活性化することにより、発芽、実生の発達、葉の形態、ストレス耐性、干ばつ耐性、根の成長、根毛の発達、およびAM菌の共生など多様な役割を担っていると考えられている。よって、本研究では、ミヤコグサkai2a変異体の抽出物および根滲出物からKLの同定を目指した。KL活性の検出には、植物抽出物をミヤコグサの発芽種子に処理後，KAI2シグナル活性化によって誘導されるDLK2の遺伝子発現を指標としたバイオアッセイを用いた。ミヤコグサkai2a変異体の発芽種子抽出物をKL抽出ソースとして、活性画分をシリカゲルカラムやHPLCで精製を進めた結果、KL候補分子を１つ特定した。水耕栽培したミヤコグサkai2a変異体の根滲出物からもKL活性が確認された。シリカゲルカラムやHPLC精製をした結果、発芽種子抽出物で特定した候補分子に加え、さらに１つのKL候補分子を特定した。これら２つのKL候補分子について、酵母にミヤコグサのKAI2とSMAX1を発現させ、yeast two-hybrid (Y2H)アッセイによるin vitroでのKL活性を評価した。その結果、2つのKL候補分子のうち、片方に陽性反応が見られ、もう片方は陰性であった。このことから陽性を示した分子が真のKLであり、もう一方はKLの生合成前駆体であると考えられた。それぞれ単離できた量がLC-MS/MS分析による概算で数十ng程度であったことから、NMR等による詳細な構造解析に足る量ではなかった。よって、今後は、これらミヤコグサ由来のKLおよびKL生合成前駆体の化学構造を決定するために、さらに大スケールでのKL生産条件の検討を行い、引き続き単離精製を進める予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ミヤコグサkai2a変異体から2つのKL候補分子を単離でき、そのうち一方はyeast two-hybrid (Y2H)アッセイにおいてKAI2とSMAX1の相互作用を誘導したところから、真のKLである可能性が極めて高い。もう一方はKL生合成前駆体であると考えられる。単離できた量は極めて微量であったが、植物ホルモンの内生量が極めて低いことは想定の範囲内である。今後は、化学構造解明のために、大スケールでの生産や生合成促進剤の探索などのKLを高生産させる方法を検討して研究を進めれば、次年度中のKL解明の可能性は極めて高いと考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後、KLの化学構造解明のために、大スケールでの生産や生合成促進剤の探索などのKLを高生産させる方法を検討して研究を進めれば、次年度中のKL解明の可能性は極めて高いと考えている。KLの化学構造が決定できたら、引き続き、その化学合成法の開発を行い、天然からの単離によらず、さらなる解析に必要な十分量のKLを調製することができる。そうして化学合成したKLを用いて、生合成経路やAM共生制御機構等のさらなる解析へと展開していく予定である。