Interaction of sperm protease with egg extracellular matrix and its application to reproduction technology

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H02949
• Research Institution: Fukushima University
• Principal Investigator: 松田 幹 福島大学, 食農学類, 教授 (20144131)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮田 真路 東京農工大学, 農学部, 准教授 (60533792) ; 大島 健司 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (90391888)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 受精 / 卵透明帯 / アクロシン / 精子プロテアーゼ / ZPタンパク質

Outline of Annual Research Achievements

研究計画初年度である今年度は、ヒトやラットとは異なり、ZP2,ZP3およびZP4でZPが構成されており精子プロテアーゼの研究が最も進んでいるブタを最初の研究対象にして組換えアクロシンの研究を進めた。ブタアクロシン前駆体のcDNA配列を元に、開始コドンから終始コドンまでを同じ短い配列を末端に共有する２つのDNA断片として化学合成し、In-fusionクローニング法を用いて連結し昆虫細胞発現ベクターに挿入した。得られたプラスミドDNAをトランスフェクション法によりショウジョウバエS2細胞に導入し一過性に分泌発現させた。培養上清のタンパク質を濃縮し、SDS-PAGEおよび免疫ブロット法により、組換えアクロシンタンパク質の発現を調べた。免疫ブロット法により成熟型アクロシンのアミノ酸配列から推定される分子量の位置に明確なバンドが検出され、培養上清にブタアクロシンが分泌発現されたことが示唆された。ブタアクロシンの分泌発現が確認されたので、哺乳類の種間での比較解析をするために、ヒト、マウス、ラット、ウシのアクロシンについて、ブタで用いた方法と手順でS2細胞での一過性分泌発現を試みた。いくつかの工夫と実験の結果、ブタを加えて5種の哺乳類のアクロシンをS2細胞の発現系で分泌発現させることができることを確認できた。さらに、アクロシンの基質となるブタZPタンパク質についても同様にS2細胞での分泌発現を試みたが、成功には至らなかった。分泌発現が難しい理由としてZPタンパク質は細胞外マトリクス構成成分であり、疎水性、難溶性であることが推測された。そこで、疎水性タンパク質の発現に用いられるマルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質として発現させることを試みた。その結果、ZP2,ZP3およびZP4のいずれもMBP-融合タンパク質としてS2細胞で分泌発現させることに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の研究計画では、ヒトやラットとは異なり、ZP2,ZP3およびZP4でZPが構成されており、精子プロテアーゼの研究が最も進んでいるブタを主な対象にして研究を進め、精子プロテアーゼ・アクロシンと卵透明帯ZPタンパク質を分泌発現させ、アクロシンとZPタンパク質との相互作用の解析を進める計画を立てた。ブタアクロシンタンパク質およびブタZP2, ZP3, ZP4の分泌発現には成功したが、ザイモグラフィーによる活性測定においてはアクロシンの明確な活性が検出できなかった。そこで、アクロシンとZPタンパク質の相互作用は一旦棚上げとして、他の哺乳類アクロシンの分泌発現を試みた。結果として、５種の哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ）の精子プロテアーゼについて前駆体タンパク質の発現と、プロセシングによる成熟型への変換に成功した。さらにブタの3種のZPタンパク質を全てMPB融合タンパク質として分泌発現させることもできた。以上のように、当初の計画の一部は達成できなかったが、次年度以降に予定していた計画の一部を達成することができた。このような状況から研究は概ね順調に進捗していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後も引き続き、活性を持つ組換え型のアクロシンとMBP-ZPタンパク質を用いてin vitroでの生化学的研究を行う。
これまでに５種の哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ）の精子プロテアーゼについて前駆体タンパク質の発現と、プロセシングによる成熟型への変換に成功した。そこで今後は、これらの成熟型タンパク質のプロテアーゼ活性を定量的に解析することを目指す。また、哺乳類のアクロシンの比較対象として鳥類のアクロシンを同様に分泌発現させる。これらの分泌アクロシンについて、これまでにSDS-電気泳動で分離しゲル内でSDSを除去してリフォールドさせた後、ザイモグラフィーでの活性染色によりプロテアーゼ活性を測定してきたが、およその傾向は掴めたものの実験誤差も大きく、SDS-処理とリフォールドの操作による活性への影響も考えられる。そこで生の状態での組換体タンパク質のプロテアーゼ活性の定量を試みる。トランスフェクションにより５種の哺乳類精子プロテアーゼを分泌発現させたS2細胞の培養上清を限外ろ過により濃縮し、トリプシン用合成基質BAPAを用いて比色定量する。基質分解による発色を連続的にモニターし吸光度の上昇速度により活性を求め、これまでのザイモグラフィーの結果も含め、動物種間で比較解析する。
一方、これまでに卵膜ZP糖タンパク質についてはブタの卵膜を構成するZP2, ZP3およびZP4をMBPとの融合タンパク質として分泌発現させることに成功したので、今後は、これらのZP糖タンパク質がブタの組換え方アクロシンで切断、分解されるかを調べる。ブタの系で、組換え型プロテアーゼとZP糖タンパク質をSP2細胞で分泌発現させ、限外ろ過で濃縮した後に混合し、酵素反応させた後に電気泳動・免疫ブロット法によりMBP-ZP融合タンパク質の分解の程度を調べる。分解断片の分子サイズを元に３種のZP糖タンパク質のいずれが、どの程度分解されるかを推定する。