2020 Fiscal Year Annual Research Report
Function of the new open reading frame appeared by cytoplasmic splicing in plants
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20H02950
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Research Institution | Osaka Prefecture University |
Principal Investigator |
小泉 望 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (20252835)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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Keywords | 小胞体ストレス応答 / シロイヌナズナ / 細胞質スプライシング / 転写因子 / 細胞内局在 |
Outline of Annual Research Achievements |
小胞体ストレス応答における小胞体から核への情報伝達機構において生物種に共通して保存されているIRE1による細胞質スプライシングが重要な役割を果たす。細胞質スプライシングの結果、小胞体シャペロン等の転写を促進する転写因子が活性化されるが、その活性化様式が酵母、動物、植物で大きく異なる。植物では、IRE1が小胞体膜に結合している転写因子bZIP60のmRNAの細胞質スプライシングを起こし、その結果bZIP60が膜貫通ドメインを失って核へ移行する。加えて、細胞質スプライシングの結果生じるbZIP60には新たな読み枠に由来する39アミノ酸からなる領域(ORF2)が付加される。このORF2の機能は不明であったが、シロイヌナズナのプロトプラストを用いた実験系からORF2が転写因子の活性化を上昇させることが明らかとなったがデータにバラツキが見られた。そこで、アッセイに用いる3つの遺伝子を連結し、ベンサミアナタバコへのアグロバクテリウムのインフィルトレーションにより検証を行うこととした。bZIP60の標的遺伝子であるBiP3のプロモーター下で制御されるルシフェラーゼの活性をより精度よく測定することを目的とした。しかし、3つの遺伝子を連結したコンストラクトを作成することが出来ず別々にアグロバクテリウムによるインフィルトレーションを行った。やはりデータにバラツキが見られたがシロイヌナズナのプロトプラストを用いた場合と同様の結果が観察された。 ORF2の細胞内局在への影響を観察するためにGFPにORF2(およびそのバリアント)を連結したコンストラクトを導入したBY2細胞を作出した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ORF2が標的遺伝子の活性化に果たす役割の解析 ベンサミアナタバコへのアグロバクテリウムによるインフィルトレーションでORF2の標的遺伝子の活性化への寄与を検討した。35Spro:bZIP60(複数のバリアントを用意)、BiP3pro:LUC、35Spro:RLUCの3つのプラスミドを用いデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。概ねORF2を有するbZIP60sはORF2を持たないbZIP60ΔC(216)の数倍から数10倍の活性を示した。さらにORF2内の重要なアミノ酸を特定するために決失、変異を入れたbZIP60sを作成し同様の実験を行ったところ、シロイヌナズナのプロトプラストを用いた場合の結果と類似した傾向を示した。従ってニコチアナタバコも実験に用いることが可能であることが明らかとなった。インフェクションの操作自体はプロトプラストを用いた実験系より容易であるが、実験結果のバラツキはむしろベンサミアナタバコの方が大きかった。 ORF2が付加されることでタンパク質の局在が変化することが考えられた。つまり、核への局在促進である。そこでORF2の細胞内局在への影響を調べるためにbZIP60の複数のバリアントとGFPとの融合タンパク質を作成し、BY2細胞に導入して蛍光を観察することで細胞内の局在性を調べることとした。形質転換BY2細胞は作出し、蛍光を示すことは確認したが、その詳細な細胞内局在は観察できていない。
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Strategy for Future Research Activity |
ORF2で重要な役割を果たすアミノ酸についてより明瞭な結果を得るために、シロイヌナズナのプロトプラストを用いて再現性よくトランジエントアッセイを行う実験系を確立する。 ORF2の付加により、タンパク質の安定性が変化する可能性が考えられるため、ウエスタンブロッティングによるタンパク質の蓄積量の検出を進める。 GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在性についてもレーザー顕微鏡を用いてさらに詳細に調べる。これらの実験を通してORF2が転写活性化に関与するメカニズムをアミノ酸配列の点から明らかとする。 ORF2と相互作用するタンパク質の同定 ORF2の付加によりbZIP60の転写活性化能が上昇する理由として、何らかのタンパク質とORF2が相互作用する可能性が考えられる。そこでそのタンパク質の同定を目指す。アプローチは2つのタグを付加したbZIP60を植物で発現させ、2段階でタンパク質を精製する(Tandem Affinity Purification)。その際、形質転換する植物はbZIP60破壊株とし、導入する遺伝子は細胞質スプライシングの結果、ORF2を有するbZIP60sが生じるコンストラクトとORF2を持たないbZIP60つまりbZIP60ΔCを生じるコンストラクトを用いる。両者で得られたタンパク質で差があるものを質量分析により同定する。同定できたタンパク質が実際にORF2と相互作用するかどうかを酵母ツーハイブリッドおよびBiFC法により確認する。
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