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2022 Fiscal Year Annual Research Report

活性酸素の受容体による柔軟な植物免疫誘導機構の分子基盤

Research Project

Project/Area Number 20H02984
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

吉岡 博文  名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30240245)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords活性酸素 / ROSセンサー
Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、植物免疫応答の鍵を握るROSセンサータンパク質を網羅的に探索し、機能を調べることによってROSによる免疫統御機構を明らかにすることである。ROSは、世界中で防御応答のマーカーとして観察されているが、その作用機構について説明することができない。ROSであるH2O2は、そのセンサータンパク質のシステインのチオール基 (-SH) を酸化し (-SOH;スルフェン酸)、分子内または分子間でジスルフィド結合を形成する。あるいは、スルフェン酸が還元型グルタチオン (GSH) と反応してS-グルタチオン化 (-S-SG) することによってROSセンサータンパク質の構造を変化させ、様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。
これまでに、PTIおよびETIにおいてスルフェニル化されると予想される多くのタンパク質を得ることができた。これらの中で、カルシウムチャネルと予想される候補タンパク質を大腸菌で発現させ、リコンビナントタンパク質を得た。リコンビナントタンパク質を過酸化水素によって酸化させ、スルフェン酸と特異的に結合するdimedoneを加えた後、抗システイン-dimedone抗体を用いてウエスタン解析した。その結果、候補タンパク質がin vitroでスルフェニル化されることを確認した。本年度は、さらに、標的システインをアラニンに置換した変異リコンビナントタンパク質は、スルフェニル化されないことを確認した。
ベンサミアナタバコ葉において候補遺伝子を抑制し、病原菌に対する影響を調べた。その結果、ジャガイモ疫病菌および灰色かび病菌が著しく感染するようになった。さらに、ベンサミアナタバコ葉に発現させ、病害シグナルを与えた後に免疫沈降することで標的タンパク質を回収し、in vivoでスルフェニル化されることを確かめた。しかし、現時点ではLCMS/MS解析の結果は得られていない。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

ROSは、植物免疫応答を局部的、全身的あるいはPTIおよびETIにおいて重要なシグナル分子であると認識され、世界中で防御応答のマーカーとして観察されているが、その作用機構について説明することができない。ROSであるH2O2は、そのセンサータンパク質のシステインのチオール基 (-SH) を酸化し (-SOH;スルフェン酸)、分子内または分子間でジスルフィド結合 (-S-S-) を形成する。あるいは、スルフェン酸が還元型グルタチオン (GSH) と反応してS-グルタチオン化 (-S-SG) することによってROSセンサータンパク質の構造を変化させ、様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。
これまでに、YAP1を用いてROSセンサーを網羅的に探索し、PTIおよびETIにおいてスルフェニル化されると予想される多くのタンパク質を得ることができた。これらの中で、カルシウムチャネルと予想される候補タンパク質を大腸菌で発現させ、リコンビナントタンパク質を得た。リコンビナントタンパク質を過酸化水素によって酸化させ、スルフェン酸と特異的に結合するdimedoneを加えた後、抗システイン-dimedone抗体を用いてウエスタン解析した。その結果、候補タンパク質がin vitroでスルフェニル化されることを確認した。
本年度は、ベンサミアナタバコ葉において候補遺伝子を抑制し、病原菌に対する影響を調べた。その結果、ジャガイモ疫病菌および灰色かび病菌が著しく感染することが確かめられた。さらに、候補遺伝子を抑制したベンサミアナタバコにおいて、スルフェニル化されるシステインを置換した変異候補遺伝子では、灰色かび病菌に対する抵抗性を相補することができなかった。この結果は、標的システインが抵抗性発現において重要な役割を果たすことを示している。以上のように、おおむね予定通り研究が進展した。

Strategy for Future Research Activity

これまでに、カルシウムチャネルと予想される候補遺伝子のコンビナントタンパク質を過酸化水素によって酸化させ、スルフェン酸と特異的に結合するdimedoneを加えた後、抗システイン-dimedone抗体を用いてウエスタン解析した。その結果、候補タンパク質がin vitroでスルフェニル化されることを確認した。さらに、得られたROSセンサーのスルフェニル化の機能を解析する目的で、dimedoneより強くスルフェニル化されたシステインと結合するBTD (benzothiazine-based probe) で化学ラベルし、コンビナントタンパク質が過酸化水素によって酸化されることを確認した。また、ベンサミアナタバコ葉に候補遺伝子を発現させ、病害シグナルを与えた後に免疫沈降することで標的タンパク質を回収し、in vivoでスルフェニル化されることを確かめた。しかし、現時点ではLCMS/MS解析の結果は得られていない。
本年度は、dimedoneに比べて100倍以上スルフェニル化されたシステインとの反応性が高いBTDを用いてin vivoにおける候補タンパク質のスルフェニル化を調べる。タグを付加した候補遺伝子をベンサミアナタバコ葉で発現させ、病害シグナルを与えた後に免疫沈降することで標的タンパク質を回収し、in vivoでスルフェニル化されることを確かめる予定である。

  • Research Products

    (7 results)

All 2023 2022

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Dynamics of plant immune MAPK activity and ROS signaling in response to invaders2023

    • Author(s)
      Hirofumi Yoshioka, Yuta Hino, Keiichiro Iwata,Takaya Ogawa, Miki Yoshioka, Nobuaki Ishihama, Hiroaki Adachi
    • Journal Title

      Physiological and Molecular Plant Pathology

      Volume: 125 Pages: -

    • DOI

      10.1016/j.pmpp.2023.102000

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Proteomic screening and functional analysis of plant immune ROS sensors: NbGLR positively regulates plant immune responses2023

    • Author(s)
      Yuta Hino, Keita Okamoto, Taichi Inada, Miki Yoshioka, Tatsuhiko Kondo, Hitoshi Mori, Hirofumi Yoshioka
    • Organizer
      第64回日本植物生理学会年会
  • [Presentation] 過硫化システイン (Cys-SSH) および多硫化システイン (Cys-SSnH, n≧1) は植物免疫応答におけるROSシグナルを介在する2023

    • Author(s)
      日野雄太・岡本渓太・稲田太一・吉岡美樹・吉岡博文
    • Organizer
      令和5年度日本植物病理学会大会
  • [Presentation] NbGLR3.7, a candidate of ROS sensor protein, positively regulates plant immune responses in a target cys-teine-dependent manner2022

    • Author(s)
      Yuta Hino, Keita Okamoto, Taichi Inada, Miki Yoshioka, Tatsuhiko Kondo, Hitoshi Mori and Hirofumi Yoshioka
    • Organizer
      12th Japan-US Seminar in Plant Pathology
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Dynamics of plant immune MAPK activity in response to pathogen and insect attacks2022

    • Author(s)
      Hirofumi Yoshioka, Yuta Hino, Kenichiro Iwata, Hiroaki Adachi, Nobuaki Ishihama and Miki Yoshioka
    • Organizer
      12th Japan-US Seminar in Plant Pathology
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] ROSは植物免疫に関わるROSセンサータンパク質候補 NbGLRの標的システインを酸化する2022

    • Author(s)
      日野雄太・岡本渓太・稲田太一・吉岡美樹・近藤竜彦・森 仁志・吉岡博文
    • Organizer
      令和4年度日本植物病理学会関西部会
  • [Presentation] Mining of ROS sensor proteins that positively regulate plant immune responses2022

    • Author(s)
      Hirofumi Yoshioka, Yuta Hino, Keita Okamoto, Taichi Inada, Tatsuhiko Kondo, Hitoshi Mori and Miki Yoshioka
    • Organizer
      The 12th International Conference on the Biology, Chemistry, and Therapeutic Applications of Nitric Oxide
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2023-12-25  

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