2020 Fiscal Year Annual Research Report
How Is Insect Sex Determined Cell-Autonomously? Verification by one-cell sequencing method using cells derived from male and female mosaic silkworm embryos
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20H02996
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 雅京 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 准教授 (30360572)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横山 岳 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (20210635)
酒井 弘貴 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 研究員 (30814660)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 性決定 / 性分化 / 雌雄モザイク / 脂肪体 / シングルセルシーケンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫は性ホルモンを持たずに細胞自律的に性が決まると言われてきた。その根拠として、雌雄モザイクと呼ばれる１つの個体に雄のと雌の組織が共存する現象があげられる。しかし、幼若ホルモンやエクダイソンが、様々な性特異的形質の発達に関わるとの報告もある。本研究では「昆虫の性は細胞自律的に決まる部分と細胞非自律的に決まる部分との総体からなる」との仮説をたて、これを検証するために雌雄モザイク個体の性分化を細胞レベルで捉えることにした。まず、体表の着色パターンに基づいて雌雄モザイクを選別できるカイコ系統を用い、体表にみられる性モザイクのパターンと脂肪体における雌雄の関係性について調べた。程度の異なるモザイク体の脂肪体における性決定・性分化遺伝子群の発現量を調べた結果、左右半身性モザイク体についてはある程度の相関性が見られることがわかった。次に、左右半身性モザイクの生殖巣の形態を観察したところ、生殖巣の形態が左右で異なる（一方が精巣様、もう一方が卵巣様）場合や奇形がみられることがわかった。これらの生殖巣における精子形成、卵形成関連遺伝子の発現量を調べた結果、雌雄モザイク体の生殖巣は正常個体とは異なるユニークな性分化を呈することが予想された。次に、脂肪体細胞のscRNA-seq実現に向け5齢幼虫の脂肪体から細胞を単離するための条件検討を行った結果、30℃、3時間のdispase処理（最終濃度1.2U/mL）により、3頭のカイコから最大で100万個の細胞（生存率 80%以上）が得られることがわかった。この方法によって得られたサンプルをscRNA-seq解析に供試したところ、雌雄の脂肪体由来の細胞は明瞭に異なるクラスターを形成し、雌雄モザイク由来の細胞はその境界領域にクラスターを形成することが判明した。また、雌雄モザイク特有のクラスターを同定し、それらにおいて特異的に高発現する遺伝子を見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた通り、脂肪体からシングルセルシーケンスに適した細胞分取条件検討を行い、シングルセルシーケンスに耐えうる十分な細胞数と高い生存率を誇る細胞分手法を確立した。さらに研究分担者の横山岳准教授（東京農工大学）の協力により、予定通り雌雄モザイク体の作製と飼育を行うことができた。これらの雌雄モザイク体は表皮の色により雌雄モザイクの程度を識別することが可能であるが、体内組織である脂肪体がどの程度の雌雄モザイク度を示すか不明であったため、この点についても性決定遺伝子の発現や雌の脂肪体で高発現する遺伝子の発現量を調べることで明らかにすることができた。その結果、表皮が斑モザイク状に見られる雌雄モザイクより、左右半身性モザイクの方が脂肪体における雌雄モザイクの程度が激しいことが明らかとなった。このような条件検討を終えた上で万全の体制でシングルセルシーケンスに供試する細胞を調製し、受託サービス業者（日本ジーンウィズ）によるシングルセルシーケンス解析を実施すべくサンプルを輸送したが、輸送中に細胞がアグリゲーションを起こし、さらに死細胞の割合が増えるなど予想外のアクシデントに見舞われ、輸送条件を検討しなければならないという想定外の事態に陥ったものの、これについても解析機器の出張解析という形で克服することができた。最終的に、雌雄モザイク脂肪体由来の細胞をシングルセルシーケンス解析にまで持ち込み、解析結果を得るところまでこぎ着けることができた。一方で、もう一つ予定していた胚子由来の細胞を分取するための条件検討については、研究分担者である酒井弘貴研究員（国研農研機構）と共に実施したもののシングルセルシーケンスに耐えうる十分な生細胞を得るには至らなかったため、引き続きこの点については条件検討の余地が残されている。以上の理由により、現在までの進捗状況は「おおむね順調に進展している」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述の「現在までの進捗状況」の項目で述べた通り、脂肪体からの細胞分取の条件検討は一通り完成段階に至ったが、更に品質の良い細胞を精製するため、パーコールなどを用いた密度勾配遠心法を適用し、セルデブリなどの不純物除去を試みる。また、脂肪体由来の細胞についてはすでにシングルセルシーケンス解析データを得ることができたが、現時点では1回だけの実験であるため、再び雌雄モザイク体から得た脂肪体由来の細胞をシングルセルシーケンスに供試し、再現性の確認を行う。また、当初の予定では、性決定のマーカー遺伝子の発現を参照にしてシングルセルシーケンスデータを読み取ることにより雌雄の細胞を識別する予定であったが、実際にシングルセルシーケンスデータを解析すると、性決定マーカー遺伝子の発現量が低すぎるため、マーカー遺伝子の発現に基づく雌雄の細胞の識別が不可能であることがわかった。そこで本年度はこの点をクリアするための方法を開発する。まず一つ目の方法は、性決定遺伝子の発現量が微量であってもルーペブラウザ上で可視化できるようなアルゴリズムを開発することである。もう一つの方法は性決定遺伝子には頼らず、新たな雌雄鑑別用マーカー遺伝子を開発することである。そのために研究分担者である酒井弘貴研究員がW染色体に恒常的に高発現するGFP遺伝子を組込んだトランスジェニックカイコ系統を現在作出中である。この系統が出来上がれば、GFPの発現を指標として雌細胞を識別することが可能となる。以上、再現性の確認、並びに雌雄の細胞判別方法が確立されたなら、シングルセルシーケンスデータをより詳細に解析し、雌雄モザイクにおける脂肪体の性分化状態について細胞レベルで明らかにする。一方、当初予定していた胚子からの細胞分取については、昨年度行った条件検討の結果に基づき再チャレンジし、シングルセルシーケンスクオリティーの細胞分取方法を確立する。
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