2020 Fiscal Year Annual Research Report

汎用性および実用性を高める新たな樹木ゲノム編集技術の確立

Research Project

Project/Area Number	20H03037
Research Institution	Forest Research and Management Organization
Principal Investigator	西口満国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員等 (80353796)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	上野真義国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員等 (40414479) 宮澤真一国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員等 (10578438) 田原恒国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員等 (70445740) 遠藤真咲国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (40546371)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	遺伝子組換え / ゲノム編集 / 樹木 / スギ / ユーカリ
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、樹木のゲノム編集技術の汎用性および実用性を高めるために、新たなゲノム編集技術を確立する。具体的な研究目的は、①ポプラ・スギ以外の樹木へゲノム編集技術を拡大するためのユーカリのゲノム編集技術の開発、②交配による非組換え型ゲノム編集スギへの転換技術の開発、③樹木（スギ）の複数の性質（遺伝子）を同時にゲノム編集するためのマルチプレックスゲノム編集技術の開発である。本年度は、ユーカリ（Eucalyptus camaldulensis）のフィトエン不飽和化酵素（PDS3）遺伝子をゲノム編集するため、E. camaldulensisおよびEucalyptus grandisのゲノムに存在するPDS3遺伝子のDNA配列を探索した。シロイヌナズナのPDS3タンパク質（566アミノ酸）の配列をクエリーとして各ユーカリのゲノムデータベースを調べたところ、E. camaldulensisのPDS3（EcPDS3、519アミノ酸）とE. grandis のPDS3（EgPDS3、583アミノ酸）を発見した。EcPDS3およびEgPDS3のcDNA配列と相同性を示すE. camaldulensisおよびE. grandisのゲノムDNA領域の塩基配列から、CRISPR/Cas9の標的配列を選抜し、ゲノム編集ベクターを作製した。また、組換え型ゲノム編集スギと非組換えスギとの交配によって、カナマイシン耐性遺伝子などの外来遺伝子を喪失した非組換え型ゲノム編集スギを作製するため、ACOS5遺伝子をゲノム編集した無花粉スギの雌花に、非組換えのスギ品種である「信夫」または「クモトオシ」の花粉を交配して得られた種子（F1）を発芽させ、育成した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 初年度の研究目標であった、ユーカリゲノム編集ベクターを作製し、ゲノム編集スギと非組換えスギの子F1を育成した。しかし、F1の外来遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子、Cas9遺伝子）の解析はまだ途中である。また、スギのマルチプレックスゲノム編集ベクターの作製も途中である。
Strategy for Future Research Activity	作製したユーカリゲノム編集ベクターは、アグロバクテリウム法を用いてユーカリ（E. camaldulensis）の胚軸に導入し、カナマイシン耐性シュートを選抜する。非組換え型ゲノム編集スギへの転換技術については、子F1を育成しつつ、外来遺伝子の有無を調べる。外来遺伝子を持たない個体にジベレリンを噴霧して、花成を誘導する。マルチプレックスゲノム編集ベクターを作製し、スギの不定胚形成細胞に導入する。