2021 Fiscal Year Annual Research Report
in situ三次元磁場配向NMRによるセルロース-分解酵素複合体の構造解析
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20H03043
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
久住 亮介 京都大学, 農学研究科, 助教 (70546530)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
和田 昌久 京都大学, 農学研究科, 教授 (40270897)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 固体NMR / 磁場配向 / in situ測定 / 単結晶振動パターン / セルロース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、液体中における微小な結晶の単結晶構造解析が可能なin situ三次元磁場配向NMRシステムを新たに構築し、結晶セルロース－染料複合体をモデルとして同システムによる構造・ダイナミクス解析手法を確立した上で、同手法による結晶セルロース－セルラーゼ複合体の結合部位における局所構造とその動態を解明することを目的としている。二年目となる2021年度は、当初の研究計画に基づき次の課題を遂行した。
課題(A)：in situ三次元磁場配向NMRシステムの構築
前年2020年度では、試料管の変調回転軸とその軸をNMR測定時にのみ傾斜させることのできる二軸可変型の磁場配向プローブを開発した。しかしながらスペクトルの分解能・感度ともに不十分であり、セルラーゼなどの複雑系への適用は困難であった。そこで2021年度においては、まずラジオ波コイル周りの設計を見直し、NMRプローブとしての性能の向上に取り組んだ。前年度型では樹脂製の試料管のみをコイル周りで傾斜させる機構であったが、ソレノイドコイルをガラス試料管とともに傾斜させるよう改良した結果、共鳴ピークを大幅に先鋭化することに成功した。モデル試料を用いて変調回転磁場下での固体NMR測定を行った結果、化学シフトテンソルを従来法と同等以上の精度で決定することができた。以上により、in situ三次元磁場配向NMRシステムを完成させた。
課題(B)：染料系をモデルとしたin situ三次元磁場配向NMRによる構造・動態解析手法の確立
13Cラベル化バクテリアセルロースを微細化し、13Cラベル化セルロースナノ結晶/水懸濁液を調製した。酵素触媒重合を通じて13Cラベル化セルロースII型の板状結晶の水懸濁液も準備した。静磁場下でin situ固体NMRを行った結果、磁場応答性のセルロース懸濁液が得られていることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は、次の3つの小課題にて構成されている。課題(A)、in situ三次元磁場配向NMRシステムの構築；課題(B)、染料系をモデルとしたin situ三次元磁場配向NMRによる構造・動態解析手法の確立；課題(C)、結晶セルロース－セルラーゼ複合体のin situ構造・動態解析。
二年目となる2021年度は、まず課題(A)のin situ三次元磁場配向NMRシステムの性能の向上に取り組んだ。溶液NMR用のガラス試料管とソレノイド型コイルとの同時傾斜機構を新たに採用することで、スペクトルの分解能・感度とも大幅に向上させることに成功した。得られたスペクトルを用いて実際に化学シフトテンソルを決定したところ、単結晶NMR法など既往の手法と同等以上の高精度な結果を得ることができた。これにより、結晶セルロース－セルラーゼ複合体などのin situ構造解析に必要なシステムの構築が概ね完了したと言える。
上記と並行し、課題(B)および(C)にて解析対象となる試料の準備を行った。酢酸菌の13Cラベル化培地での培養を通じ、13Cラベル化されたセルロースナノ結晶/水懸濁液を調製した。また、セロデキストリンホスホリラーゼを利用した酵素触媒重合により、13Cラベル化されたセルロースII型の板状結晶の水懸濁液の作製にも成功している。静磁場下で得られたin situ固体NMRスペクトルを用いてシミュレーション解析を行った結果、磁場応答性のセルロース懸濁液が得られていることが分かった。
以上の成果から、本研究課題は概ね計画通り順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画に沿って、下記の課題を遂行する。
課題(B)：染料系をモデルとしたin situ三次元磁場配向NMRによる構造・動態解析手法の確立
13Cラベル化セルロースナノ結晶(CNC)/水懸濁液をin situ三次元磁場配向NMRに供し、13C化学シフト(CS)テンソルを決定する。同様に、13Cラベル化セルロースII型の板状結晶(CIIOC)についても解析する。次に、Congo Redなどの直接染料を各ラベル化セルロースに作用させ、セルロース－染料複合体の懸濁液を調製する。in situ三次元磁場配向NMRにより結合部位における13C CSテンソルを決定し、量子化学計算を援用して局所構造を精密化する。温度可変下での緩和時間測定も行い、結合部位における分子ダイナミクスを解析する。その上で、CNC/CIIOC・染料単体とセルロース－染料複合体の比較考察を通じ、結合部位の局所構造と運動性の変化について論じる。in situ三次元磁場配向NMRによる構造・ダイナミクス解析の理解を深め、課題(C)に向けた解析ノウハウを集積する。
課題(C)：結晶セルロース－セルラーゼ複合体のin situ構造・動態解析
大腸菌発現系により、Tyr残基が13Cラベル化された子嚢菌T. reesei由来の糖結合モジュール(CBM)を調製する。これを13Cラベル化CNCに懸濁液中で作用させ、in situ三次元磁場配向NMRに供して結合部位における13C CSテンソルを決定する。また、解析精度の向上のため固体13C－13C長距離相関NMRによりCNC－CBM結合部位の原子間距離情報を取得するとともに、温度可変測定によるダイナミクス解析を達成する。既往のCBMの立体構造やCNC単独の構造データ等との比較考察を通じ、CNC－CBM結合部位における局所構造や分子運動性の変化、脱吸着などの動態を解明する。
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