2020 Fiscal Year Annual Research Report

Study on the mechanism of antibody transport to avian egg yolks by PLA2R receptor and its application to produce eggs rich in IgY

Research Project

Project/Area Number	20H03128
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	村井篤嗣名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (10313975)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	水島秀成北海道大学, 理学研究院, 助教 (20515382)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	畜産学 / 栄養生理学 / 鳥類 / 卵 / 抗体 / ゲノム編集
Outline of Annual Research Achievements	・PLA2RのIgY受容体機能を解析するために、この受容体を高レベルに強制発現させたMDCK細胞株（イヌ腎臓尿細管上皮細胞株）の樹立を目指した。外来遺伝子の導入効率が高いエレクトロポレーション法を採用したことで、最終的にPLA2Rを子レベルで発現する細胞株を樹立することができた。PLA2Rを発現していない対照となるMOCK細胞株の樹立にも成功した。・これら２つの細胞株ををトランスウェルシステム上で培養し、培養液に添加したIgYの細胞内輸送量を調査した。しかしながら、トランスウェルを通過するIgYの輸送量は添加したIgYの0.05%以下にとどまり、PLA2Rの発現量にかかわらず、細胞を透過するIgY量を測定するのは困難であることが判明した。・卵黄へのIgY輸送能が異なるIgY変異体を培養液に添加して、PLA2Rを強制発現させた細胞株への取り込み量を測定した。対照となるMOCK細胞株に比べて、PLA2Rを強制発現させた細胞株では全てのIgY変異体の取り込み量が高くなった。そして、予想に反して卵黄への輸送能が最も低いIgY変異体（Y363A）の取り込み量が最も高くなった。以上より、PLA2Rは細胞内へのIgYの取り込みを増加させる能力を有すること、卵黄へのIgY輸送能が低いIgY変異体は逆にPLA2Rとの結合が強いために輸送量が減少する可能性が示唆された。・CRISPR-Cas9システムによるPLA2R欠損ウズラの作出を進めた。DF1細胞（ニワトリ繊維芽細胞株）に候補ガイドRNAの発現ベクターを導入し、single strand annealing アッセイ法を利用してPLA2R遺伝子の切断効率が最も高いガイドRNAを選抜した。このガイドRNAをウズラの受精卵に導入し、生体内でもPLA2R遺伝子の切断が起こることを検証した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和2年に作出したPLA2Rの強制発現細胞株は、PLA2Rの発現レベルが低いことが判明し、令和2年12月から遺伝子発現ベクターの導入条件を見直して、令和３年の1月から再度PLA2R高発現株のスクリーニングを実施した。そのため令和２年度の経費を令和3年度に繰り越して本研究課題を実施した。最終的に、令和2年度当初の実施計画を完遂することができた。よって、現在までに本研究課題はおおむね順調に進展していると考える。
Strategy for Future Research Activity	PLA2Rを高レベルに発現する細胞株を樹立することができた。この発現細胞株を用いたIgY変異体の取り込み試験によって、PLA2RがIgYの細胞内への取り込みを促進する可能性が示された。一方、取り込み能が最も高くなったIgY変異体は、卵黄へほとんど輸送されない変異体であった。今後は、PLA2RとIgY変異体との分子間相互作用を検証することで、PLA2RによるIgYの輸送機構を明らかにしていく。PLA2Rの欠損ウズラの作出は順調に進んでおり、次年度はウズラの受精卵へCRISPR-Cas9を導入して、PLA2Rを欠損する第１親世代を得る。