2021 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanism for the roles of cholesterol-binding membrane protein TSPO2 in terminal erythroid differentiation
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20H03138
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
稲葉 睦 北海道大学, 獣医学研究院, 教授 (00183179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高田 健介 北海道大学, 獣医学研究院, 准教授 (40570073)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 赤芽球造血 / 赤血球 / コレステロール / コレステロール結合蛋白質 / 貧血 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．遺伝子組換えマウスの作出：TSPO2-HAを発現する遺伝子組換えマウスを作出し、その骨髄赤芽球系細胞におけるTSPO2-HA発現状況を免疫染色等で検討した。ヘテロ接合型、ホモ接合型、いずれの個体でもTSPO2-HAのシグナルは微弱ながら検出可能であり、フローサイトメトリーでは赤芽球終末分化・成熟過程の多染性赤芽球〜正染性赤芽球の時期に発現増加が観察された。HAシグナルは主にゴルジ装置やリソソームと一致、あるいはその近傍に認められた。エンドソームマーカーとも近接した分布が観られ、これら複数小器官の間でのコレステロール転送に働く可能性が考えられる。MEDEP細胞のTSPO2遺伝子をTSPO2-HAに組み替えた場合、あるいはこれを一過性発現させた場合にも同様の細胞内分布が認められた。一方で末梢血赤血球には検出されず、小器官消失にともないほぼ失われることが示唆された。一過性発現の場合を除き、TSPO2-HAのシグナルは比較的弱く、正常細胞での細胞内局在等解析には野生株との比較が常時必要であることが判明した。
2．コレステロールトレーサの検討：MEDEP細胞で数種の標識コレステロールの取り込みを検討したが、近年高頻度に利用されるBODIPY標識コレステロールの優位性は観察されず、従来から用いるNBD標識コレステロールの利用、あるいは至適条件下でのフィリピンやNile redによる染色がむしろ安定であることが示された。同時にLipidDyeを利用し、脂肪滴形成自体はTSPO2の影響を受けないことも明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子組換えマウスでのTSPO2-HA検出が滞ったが、ホモ接合型個体赤芽球での解析、ならびにMEDEP細胞における諸々検討で、正常な赤芽球での発現の程度と時期の概要を把握でき、TSPO2の発現は比較的弱いものの充分に検出可能、かつ細胞内分布を解析することを確かめることができた。コレステロール動態解析についても、利用可能なトレーサや手法が限定された。以上から、主に遺伝子組換えマウスで生じた研究遂行上の課題等は概ね解決でき、今後の進行の目処がたったことから概ね順調と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討から、MEDEP細胞、遺伝子組換えマウスの赤芽球、それぞれの特長を把握できた。今後は、MEDEPの正常細胞、Tspo2－/－細胞、ならびにTSPO2-HA遺伝子組換え細胞などを分化誘導し、それぞれの特長を活用して、TSPO2とコレステロールの細胞内動態を関連づけることに焦点を置く。特に遊離コレステロールとエステル型との間の変換やその動態はTSPO2の細胞内分布、機能を解く上で鍵となることが示唆されるので、これらを明確に把握することで計画を推進し得ると考える。
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