2023 Fiscal Year Annual Research Report

Studies on anti-tumor potential of symbiotic retroviruses and their therapeutic applications

Research Project

Project/Area Number	20H03150
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	宮沢孝幸京都大学, 医生物学研究所, 准教授 (80282705)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中川草東海大学, 医学部, 准教授 (70510014) 目堅博久宮崎大学, 産業動物防疫リサーチセンター, 准教授 (90633264)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ウシフォーミーウイルス / ウシ白血病 / マイクロRNA / 抗腫瘍効果 / ウイルスベクター
Outline of Annual Research Achievements	多くのレトロウイルスは宿主にさまざまな重篤な疾病を引き起こし、獣医臨床上大きな問題となっている。ところがレトロウイルスの一種であるフォーミーウイルスは、宿主に修正持続感染するものの、いかなる疾病も引き起こさない。最近我々は、ニホンザル由来のフォーミーウイルス（SFVmfu)が、がんを抑制するマイクロRNA(miRNA）を大量に産生することを見いだした。本研究はフォーミーウイウルスが宿主のmiRNA産生系を乗っ取り、大量にmiRNAを産生するメカニズムを明らかにする。そして、これらの知見を利用して、腫瘍抑制性miRNAを強力に発現しうる新規ウイルスベクターを開発し、家畜や伴侶動物を対象とした新規がん治療法へ道を拓く。今回まず、pUC19ベクターにウシフォーミーウイルス11480株の全長を導入した。ウシフォーミーウイルスの5687-12001番目をPCR法で増幅後、In-fusionクローニング法でpUC19ベクターに導入した。このプラスミドをクローニング後、PCR法で直鎖状化し、ウシフォーミーウイルスの1-5687番目を再度、In-fusionクローニング法で導入することで、ウシフォーミーウイルスの全長をpUC19ベクターに導入することに成功した。ロングリードシークエンステクノロジーで全長配列を解析したところ、1つのプラスミドにアミノ酸変異がまったくないことを確認した。続いて、ウシフォーミーウイルスベクターで最適な遺伝子導入部位を検討するため、アクセサリー蛋白質であるborf-2の配列を削除し、そこにZsGreen1を挿入したプラスミドを作成した。今後は、HEK293T細胞にこのプラスミドをトランスフェクションして、感染性分子クローン由来ウイルスを回収し、組換えウイルスが蛍光を発するのかを検討する。さらに、このプラスミドを用いたmiRNA発現ベクターの実証試験を行う。
Research Progress Status	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。