2021 Fiscal Year Annual Research Report
Tissue-specific pre-mRNA processing in living animals
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20H03181
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
黒柳 秀人 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30323702)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 線虫 / RNAプロセシング / mRNA前駆体 / 遺伝子発現 / 代謝標識 / 新生RNA / 組織特異性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、線虫の生体で組織特異的にRNAを代謝標識して濃縮する手法を開発し、主要組織におけるmRNAのRNA-seq解析を行って、線虫における組織特異的選択的プロセシングの概要を明らかにし、転写と共役したmRNAプロセシングの進行過程と組織特異的選択的プロセシングパターンとの関連性を明らかにして、この生物種における選択的mRNAプロセシングの制御機構を体系的に理解することを目指している。
そのために、線虫の個体レベルでの新生mRNAを4-チオウリジンまたは4-チオウラシルで代謝標識する手法の確立を行った。そして、mRNAの品質管理機構であるnonsense-mediated mRNA decay (NMD)が不全であるsmg-2変異体を用いて新生RNAを標識・精製し、長リード次世代シーケンサーであるNanopore MinIONを用いて全長RNA配列を直接シーケンシング解析し、野生型のmRNAとの比較を行った結果、正常ならNMDで分解されてしまうmRNAスプライスバリアントを発現する遺伝子259個を同定し、EMBO Journal誌に発表した（2021年6月）。一方、ウラシルのサルベージ経路の酵素の変異体を入手あるいはゲノム編集で作製してスクリーニングし、シチジン/ウリジン一リン酸キナーゼをコードする遺伝子の変異体では4-TUがほとんどRNAに取り込まれないことを見出しており、この変異体の特定の組織にcDNAを発現させることで、組織特異的に発現するレスキュー株を作製している。これらの株は、各組織における遺伝子発現の解析、および新生RNAの動態解析に利用できると期待されることから、新生RNAの代謝標識と精製を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画では、作製した組織特異的レスキュー株を用いて新生mRNAの代謝標識を行い、新生RNAを精製して、標的組織のmRNAが濃縮できているか確認を行う予定であった。またしかし、代表者および主たる実験実施者の双方の不測の病気が判明したことから、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
組織特異的にRNAを代謝標識するTU-tagging法を確立する。TU-taggingだけではRNAを十分に組織特異的に濃縮できない場合は、さらに組織特異的に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック線虫株を用い、セルソーターで当該組織の細胞を濃縮することで特異性の向上を図る。
前項で確立したTU-tagging法を利用して、体壁筋、神経系、咽頭筋、腸の4組織について、組織特異的にRNAをチオ標識する。虫体全体からRNAを調製してチオ標識RNAを精製しrRNAを除去してRNA-seq解析することで、野生型線虫における各組織の成熟mRNAの選択的スプライシングパターンを網羅的に明らかにする。さらに、虫体から細胞核を調製して核RNAを調製してからチオ標識RNAを精製しrRNAとポリA+ RNAを除去してmRNA前駆体を全長シーケンシング解析する。
さらに、TU-tagging法の標識時間を短くしていくことによって、プロセシング途中のmRNA前駆体をより濃縮し、組織特異的なプロセシングの動態を明らかにすることを目指す。
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[Book] 遺伝学の百科事典2022
Author(s)
日本遺伝学会 黒柳秀人（分担執筆）
Total Pages
690
Publisher
丸善出版
ISBN
978-4-621-30660-4
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