Fluorescence detection of cellular ability of mismatch repair using synthetic DNA

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03184
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岩井 成憲 大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (10168544)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中津 可道 九州大学, 医学研究院, 准教授 (00207820) ; 織田 信弥 独立行政法人国立病院機構(九州がんセンター臨床研究センター), その他部局等, 腫瘍遺伝学研究室長 (40333372) ; 倉岡 功 福岡大学, 理学部, 教授 (60335396)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ミスマッチ修復 / 蛍光プローブ / 遺伝性大腸癌

Outline of Annual Research Achievements

令和２年度に調製した核局在化シグナルペプチドを付けた200塩基対のダンベル型蛍光プローブ（蛍光色素とその近傍にクエンチャーならびにミスマッチを有する）を用いてHeLa細胞のトランスフェクションを行ったが、ペプチドが付いていないプローブと比較して細胞への導入効率に違いが見られず、効率が低いままであった。また、トランスフェクション試薬であるLipofectamine 3000に加えてトランスフェクションが困難な細胞で用いられる補助試薬であるNupherinを試してみたが、やはり導入効率の改善は見られなかった。次に、令和２年度にも行った核抽出液を使った実験について、DNA修復の研究にも使えるPromega社のHeLaScribe Nuclear Extract, in vitro Transcription Gradeを使用して再度行った。ダンベル型DNAでミスマッチを含むものと含まないもの、さらにミスマッチを含むDNAをニッキングエンドヌクレアーゼであるNt.BsmAIで処理したプローブの３種類を試したが、蛍光強度の時間変化はほとんど同じであった。以上の結果、DNAリガーゼで調製したダンベル型蛍光プローブは細胞への導入効率が極めて低く、市販の核抽出液と組み合わせても使えないことがわかった。そこで、確実に細胞に導入することができるプラスミドを使用することとし、以前にヌクレオチド除去修復を検出するためのプローブを調製した時と同じ方法で蛍光色素/クエンチャーとミスマッチを入れたプラスミドを調製した。また、本研究で直鎖状のDNAにこだわった動機としてその方法によるプラスミドの調製には熟練が必要で一般的ではないという理由があったため、ニッキングエンドヌクレアーゼを使ってオリゴヌクレオチドを入れ換えることにより蛍光プローブを調製する方法を開発した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究で直鎖状のダンベル型DNAを蛍光プローブの骨格として使用することにしたのは、プラスミドの超遠心による精製が一般的ではないためその経験がなければプローブの調製が困難で、プラスミドでは汎用化の阻害要因となる可能性があることが理由であった。ダンベル型DNAならDNAリガーゼで調製でき、クロマトグラフィーにより精製できる。しかしながら、これまで２年間の研究の結果から、ダンベル型DNAは少なくとも１本鎖オリゴヌクレオチドやプラスミドで有効な市販のトランスフェクション試薬を使用した場合に細胞への導入効率が極めて低いことが明らかになった。このような形状のDNAを使った研究はあまり例がないので、どのような要因がトランスフェクションを阻害しているのか、あるいはダンベル型DNAに適したトランスフェクション法があるのか（リン酸カルシウム法を試したがカチオン性リポソーム法と同様であった）は不明であり、これらを研究するという方向性もあるが、DNAが細胞に入らないと本研究の目的を達成することができないため、確実に細胞に導入することができるプラスミドを使用することとした。ただし、プラスミドの調製における問題点を解決するために、令和３年度に研究分担者に加わった倉岡教授と共同で、ニッキングエンドヌクレアーゼを使ってオリゴヌクレオチドを入れ換えることにより蛍光プローブを調製する方法を開発した。同時に従来法でもプラスミド型の蛍光プローブを調製しており、令和４年度の早い時期に細胞中でのミスマッチ修復の蛍光検出を達成したいと考えている。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度に調製したプラスミドを使って、ミスマッチ修復の細胞中での蛍光検出を早急に成功させる必要がある。ヌクレオチド除去修復の場合には、蛍光色素とクエンチャーを入れたプラスミドを使うことにより、紫外線損傷塩基の有無で核からの蛍光に明らかな違いがあり、この修復系が働かない細胞とその細胞で機能しないタンパク質の遺伝子を発現させた場合の比較でも期待どおりの結果が得られた。ミスマッチ修復では最初にニック（１本鎖切断）が必要であるため、プラスミドをニッキングエンドヌクレアーゼで処理したものも試してみる。ミスマッチの有無で核から検出される蛍光に明らかな違い（ミスマッチがある場合に非特異的な分解より早く蛍光が検出される）が認められれば、プラスミド型の蛍光プローブを用いて当初予定していた基礎研究ならびに臨床応用に向けた研究を実施する。基礎研究としては、MSH2遺伝子変異のホモ接合体とヘテロ接合体のそれぞれを持つマウス胚性線維芽細胞と野生型細胞を用いてヘテロ接合体を区別できるかを調べる研究や、C/AミスマッチのCとAのどちらの鎖が優先的に分解されるかという塩基選択性の研究があり、臨床応用に向けては、患者の初代培養線維芽細胞やリンパ球においてミスマッチ修復を直接観察するという実験を計画している。また、プラスミド型の蛍光プローブについても、核抽出液でミスマッチ修復を検出できるかどうかを調べる。