2022 Fiscal Year Annual Research Report
Fluorescence detection of cellular ability of mismatch repair using synthetic DNA
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20H03184
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岩井 成憲 大阪大学, 大学院基礎工学研究科, 教授 (10168544)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
織田 信弥 独立行政法人国立病院機構(九州がんセンター臨床研究センター), その他部局等, 腫瘍遺伝学研究室長 (40333372)
倉岡 功 福岡大学, 理学部, 教授 (60335396)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ミスマッチ修復 / 蛍光プローブ / ヌクレオチド除去修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までの研究によりダンベル型DNAは少なくとも蛍光を検出できる程度には細胞に導入できないことが明らかになったため、ミスマッチを入れその近傍に蛍光色素とクエンチャーを付けたプラスミドを蛍光プローブとして使用することにした。令和3年度に簡便なプラスミドの調製法を開発したが、より確実な方法で調製したプラスミドを用いるべきであると考え、以前に報告したヌクレオチド除去修復の蛍光検出の場合と同じ方法でミスマッチを入れたプラスミドを調製した。コントロールとして完全に相補的で波長が異なる蛍光色素/クエンチャーを付けたプラスミドも調製し、これらを使ってHeLa細胞のトランスフェクションを行った。また、別のコントロール実験としてミスマッチ修復で働くMSH2遺伝子をsiRNAによりノックダウンしたHeLa細胞も使用し、３時間後と６時間後に蛍光顕微鏡による観察を行ったが、ミスマッチ修復によると考えられる蛍光は検出されなかった。複数回の実験で同じ結果となったため、プラスミドが問題なく調製できていることを確認するために、以前に行ったヌクレオチド除去修復の蛍光検出の実験を同じ実験者が試したところ、トランスフェクションの３時間後の蛍光顕微鏡による観察で核における蛍光が再現性よく検出された。いずれの修復系の蛍光検出においても蛍光色素としてフルオレセインを使用したが、修復の効率がミスマッチ修復 ＜ ヌクレオチド除去修復であれば前者の検出が困難である可能性が考えられた。そこで、より明るい蛍光色素とされるAlexa Fluor 488（ミスマッチがないコントロールではAlexa Fluor 568）ならびにその発光波長に一致するクエンチャーであるBHQ-1（同BHQ-2）を付けたオリゴヌクレオチドを調製した。ところが、その頃にプラスミドがうまく調製できなくなり、原因を調べているうちに研究期間が終了した。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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