Structural basis of LLPS of RNA repeats related to neurodegenerative diseases

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03192
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 片平 正人 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 液液相分離 / 核酸 / NMR / 構造

Outline of Annual Research Achievements

3本のDNAを調製し、互いに鎖の半分の領域が、別のDNAの半分の領域と相補的な配列となるようにした。これにより3本のDNA鎖は水素結合によって互いに会合し、3本のDNA鎖からなる一つの構造体を形成する。さらに3本のDNA鎖の5’末端には、共通の回文式配列を付加した。これにより、3本のDNA鎖からなる構造体は、さらに高次の構造体を形成し得る。この3本のDNAを溶解した溶液は、液液相分離を生じてドロプレットが形成される事が、顕微鏡観察によって明らかになった。顕微鏡下におけるドロプレットの動きを、ビデオに記録する事ができた。
上記の溶液をNMR試料管に入れて静置すると、液液相分離により2層となった。この状態における１次元NMRスペクトルを取得することができた。また、並進の拡散係数に関する情報を取得できる２次元NMRスペクトルを取得する事にも成功した。
核酸と相互作用するFUSタンパク質に関し、一様に分散した状態にピペッティングによるせん断応力を作用させると、アモルファスな凝集体が形成される事を見出した。この遷移は、液液相分離状態を経由している可能性がある。また、FUSが特異的に相互作用する核酸を加えると、上記の構造遷移が阻害される事も見出した。なお、非特異的な核酸を加えた場合は、構造遷移の阻害は見られなかった。
細胞内における核酸の構造をインセルNMR法によって解析した結果、ヒト生細胞中において3重鎖構造が形成されている事を直接的に証明する事に初めて成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

液液相分離によって生じたドロプレットの動きを、顕微鏡を用いてビデオレートで追跡する事ができた。また、液液相分離を生じた溶液に関し、NMR法を用いた解析を進行させた。インセルNMR法によって、ヒト生細胞中において非標準型構造の核酸が存在する事を示す事もできた。

Strategy for Future Research Activity

液液相分離を生じた核酸及びタンパク質に関し、顕微鏡とNMRを用いて挙動・構造・ダイナミクスについての情報を取得し、液液相分離の実像に迫る。

Research Products

• [Journal Article] Non-coding RNA suppresses FUS aggregation caused by mechanistic shear stress on pipetting in a sequence-dependent manner (2021)
  • Author(s): Hamad Nesreen、Yoneda Ryoma、So Masatomo、Kurokawa Riki、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Pages: 9523
  • DOI: 10.1038/s41598-021-89075-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Detection of parallel and antiparallel DNA triplex structures in living human cells using in-cell NMR (2021)
  • Author(s): Sakamoto Tomoki、Yamaoki Yudai、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 57 Pages: 5364-6367
  • DOI: 10.1039/D1CC01761F
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Non-coding RNA suppresses FUS aggregation caused by mechanistic shear stress on pipetting in a sequence-dependent manner (2021)
  • Author(s): Katahira, M.
  • Organizer: The 44th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
  • Invited
• [Presentation] Analysis of fused in sarcoma aggregation caused by shear stress and suppression of aggregation by non-coding RNA (2021)
  • Author(s): Kurokawa, R., Hamad, N., Yoneda, R., So, M., Kondo, K., Yamaoki, Y., Nagata, T. and Katahira, M.
  • Organizer: The 12th International Symposium of Advanced Energy Science
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] n-cell NMR analysis of the structure and dynamics of hairpin and G-quadruplex structures in the living human cells (2021)
  • Author(s): Yamaoki, Y., Nagata, T., Kondo, K., Sakamoto, T., Takami, S., and Katahira, M.
  • Organizer: 22nd International Society of Magnetic Resonance Conference
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 片平研究室
  • URL: http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/bio/