2020 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis of the iron-sulfur cluster biogenesis, and the establishment of ex-situ reconstitution system
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20H03196
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
和田 啓 宮崎大学, 医学部, 准教授 (80379304)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 康弘 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
藤田 祐一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80222264)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 鉄硫黄クラスター / X線結晶構造解析 / 窒素固定遺伝子群 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-Sクラスターは単純な構造だが、この生合成にはSUFマシナリーと呼ばれる大掛かりな蛋白質群を必要とする。本申請ではその"心臓部"といえるコア複合体に焦点をあてる。この複合体は ATP 加水分解に共役して、鉄と硫黄原子をFe-Sクラスターへ変換する。本研究の目的は、酸素に不安定なFe-Sクラスター合成超複合体の作動メカニズムの全容解明である。本年度は以下の項目を実施した。
(i) クラスター合成装置(SufB-SufC-SufD複合体)を無酸素条件下で精製した結果、緑茶色に提唱した複合体を得ることができした。このUV-VisスペクトルからFe-Sクラスターが結合していること強く示唆された。さらに、アポ型SufB-SufC-SufD複合体に鉄および硫黄源を添加し、精製することによって、SufB-SufC-SufD複合体に人工的にFe-Sクラスターを結合させることができた。
(ii)クラスター合成の中間段階の状態をトラップすることを目的に、アポ型SufB-SufC-SufD複合体と硫黄供与タンパク質群（SufSおよびSufE）を共存させ、システインを硫黄源として硫黄の伝達反応を行った。硫黄定量の結果、SufB-SufD-SufC複合体には複数個の硫黄が結合したことが分かった。
(iii)鉄硫黄クラスター結合型および硫黄結合型のクラスター合成装置に関して、無酸素条件下での結晶化条件スクリーニングを開始した。
(iv)窒素固定のマスターレギュレーターCnfRおよびClhRが結合するDNA配列をフットプリント法により解析し、それぞれが認識/結合する配列（30 bp程度）を決定することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画において、「 無酸素条件下における"無細胞"クラスター合成系の確立」と「 窒素固定のマスターレギュレーターCnfR&ChlRの機能解析」を掲げていた。上記、実績の(i)～(iii)がクラスター合成系の確立に関する進捗であり、(iv)はChlRおよびChlRの機能解析に該当する。
新型コロナ感染症の影響により、専用ロボットのチップの輸入が遅れたが、納入後にはおおむね順調に進行した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は以下の項目を進める。
・機能状態のコア複合体の構造解析を進める。X線結晶構造解析に加え、クライオ電子顕微鏡を用いた解析も並行して進める。
・窒素固定のマスターレギュレーターCnfRの構造解析を進める。これらのタンパク質の安定性が悪いことから、DNA結合型やFe-Sクラスター結合型など、ホロ型の作製。利用も踏まえて構造決定を目指す。
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Research Products
(7 results)
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[Presentation] Structural basis of the red-absorbing state of cyanobacteriochrome RcaE that regulates complementary chromatic acclimation in cyanobacteria2021
Author(s)
Takayuki Nagae, Masashi Unno, Taiki Koizumi, Yohei Miyanoiri, Tomotsumi Fujisawa, Kento Masui, Takanari Kamo, Kei Wada, Toshihiko Eki, Yutaka Ito, Masaki Mishima, Yuu Hirose
Organizer
第62回日本植物生理学会年会
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