2021 Fiscal Year Annual Research Report
病原細菌エフェクターによるNF-κB経路を標的とした感染機構の解析
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20H03198
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
水島 恒裕 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (90362269)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷 一寿 三重大学, 医学系研究科, 産学官連携講座教授 (20541204)
Kim Minsoo 京都大学, 医学研究科, 准教授 (50466835)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / エフェクター / 構造解析 / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
病原細菌はエフェクターと呼ばれる病原性タンパク質を宿主細胞に分泌し、宿主の防御応答を妨げることにより感染する。病原細菌は多数のエフェクターにより、宿主の炎症応答・細胞接着・オートファジー等の防御経路等、さまざまな防御応答の経路を阻害している。本研究では防御応答の中心的な役割を担う転写因子NF-κB経路を阻害するエフェクターを中心に、病原細菌が感染可能な環境を作り上げる分子機構の解明を目指して研究を行った。
IpaH1.4とIpaH2.5はNF-κB経路の活性化に必須なLUBAC複合体(HOIL-1L, HOIP, SHARPINから構成)を標的とするエフェクターである。これまでの研究より、IpaH1.4の2か所の塩基性の分子表面が基質との結合に関わることを示す結果を得た。そこで、基質に対するIpaH1.4のユビキチン化活性への影響を解析した。その結果、基質との結合に関与する分子表面のうちの一方はユビキチン化活性にも影響を与え、IpaH1.4の基質認識領域が特定された。また、これまで不明であったLUBACのサブユニットであるSHARPINに対するIpaH1.4の相互作用解析を行った。
エフェクターの一つであるCifはNEDD8のGln40を脱アミド化修飾することによりGlu40に変換し、宿主の細胞周期の進行を阻害する。一般的なCifファミリーとは異なる特徴をもったLegionella由来のCifの結晶化に成功していたことから、X線回折データを収集した。
病原性酵母であるカンジダ酵母のイソクエン酸リアーゼのX線結晶構造解析およびCryo電子顕微鏡解析を行い、立体構造を決定した。さらに、カンジダ酵母とは異なる機構で細胞内制御を受ける出芽酵母のイソクエン酸リアーゼの構造を決定し、それぞれの構造的な特徴の違いを考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「IpaH1.4/2.5の基質認識および反応機構の解析」において、基質との結合に関わるIpaH1.4の塩基性の分子表面を2か所特定し、ユビキチン化活性に与える影響を明らかにした。また、IpaH1.4と基質であるLUBAC複合体の構造解析を目指し、昆虫細胞を用いたLUBACの発現系を構築し、精製条件の検討を行った。「脱アミド化活性を持つエフェクターによるNF-κB活性化経路阻害機構の解析」では、基質認識に関わると考えられる部位が一般的なCifとは異なるLegionella由来のCifの結晶化に成功し、X線回折データを収集した。「その他、病原性酵母の感染に関連するタンパク質の構造解析」では病原性酵母であるカンジダ酵母のイソクエン酸リアーゼの構造をX線結晶構造およびCryoEMにより決定した。さらに、細胞内における制御機構の異なる出芽酵母イソクエン酸リアーゼとの構造的な特徴の違いを明らかにした。
これらのことから、本課題はおおむね予定通りの進捗状況であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画であげた「IpaH1.4/2.5の基質認識および反応機構の解析」において、IpaH1.4によるLUBAC複合体認識機構の解析は順調に進行しており、部位特異的変異体を用いた相互作用解析およびユビキチン化活性の解析から、基質の認識に関わる部位を明らかにした。今後は細胞内で解析を行い、これらIpaH1.4の基質認識領域がLUBACおよびNF-κB経路の活性化に与える影響を明らかにする計画である。また、Cryo電子顕微鏡解析によるIpaH1.4-LUBAC複合体の構造解析を目指し、昆虫細胞LUBAC発現系を用いた複合体タンパク質精製条件の検討を行い、負染色を用いた電子顕微鏡画像の測定により、複合体タンパク質の状態を解析する。
研究計画「脱アミド化活性を持つエフェクターによるNF-κB活性化経路阻害機構の解析」ではユビキチンやNEDD8に対する脱アミド化活性を持ったLegionella由来のCifの構造解析を目指し、結晶化、回折データ収集に成功した。Legionella由来のCifは構造既知のCifとはアミノ酸相同性が低く分子置換法による構造解析が困難であることから、今後はLegionella由来のCifの構造決定のため、SeMet誘導体結晶の作製を行い、構造解析を進める計画である。
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