2020 Fiscal Year Annual Research Report
血管収縮を調節するペプチドホルモン受容体の活性化機構の解明
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20H03210
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
土井 知子 京都大学, 理学研究科, 准教授 (00397580)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ペプチドGPCR / シグナル伝達 / 受容体薬理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ET-1による受容体活性化において、ET-1ヘリカル領域とETBとの相互作用がその構造変化に及ぼす影響を調べるため、ET-1(8-21)ペプチドを野生型として各アミノ酸残基をアラニンに置換したペプチドを用いて、Gタンパク質活性化能を検定した。この結果、Y13とF14が受容体のN末テール領域、膜貫通ヘリックス７の細胞外側とそれぞれ相互作用して、活性化構造の形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
ペプチドGPCRの活性化機構を解明するために、エンドセリン(ET)結合ETB受容体-Gタンパク質複合体構造を低温電子顕微鏡による単粒子解析によって解析することを目指し、試料の調製を行った。複合体成分は、(1) ET-1結合ETB受容体、(2) 三量体Gタンパク質Gi ならびにG11（アルファとベータ・ガンマサブユニット）、(3)三量体Gタンパク質の解離を抑制する単鎖型抗体の3種類であり、それぞれ大量発現と精製系を検討した。いずれも、昆虫細胞 (Sf9, Tn5)とバキュロウイルス発現系を用いた。(1) ET-1結合ETB受容体は、熱安定化変異を含み、C末にプロテアーゼ配列を介してEGFP-His8を融合したコンストラクトを作成、発現させた。ET-1結合変異型ETB受容体はGFPを指標に精製でき、プロテアーゼ切断後にゲル濾過によって単離した。(2) GiとG11三量体は、昆虫細胞(Sf9, Tn5)に共発現させることで三量体を形成し、His-tagが挿入されているベータサブユニットを利用して三量体を精製し、プロテアーゼでHis-tagを切断後にゲル濾過によって単離した。(3) 単鎖型抗体は、Tn5で分泌発現させ、回収培養液からHisタグを用いて精製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ペプチド変異体によるETBの活性化能の検討から、ET-1のF14とETBの膜貫通ヘリックス７の細胞外側の相互作用が結合親和性に重要であり、ET-1のY13とETBのN末テール領域の相互作用が活性型構造への移行に重要であることが解明された。
ETB受容体、Gi並びにG11三量体Gタンパク質、単鎖型抗体の昆虫細胞におけるそれぞれの発現および精製系は確立できた。これらを混合して複合体を形成させ精製する過程を検討中である。単離できれば、負染色像を電子顕微鏡観察し、複合体の単分散性や安定性を確認する。
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| Strategy for Future Research Activity |
ETBの活性化機構を検定するために、これまではin vitro GTPgammaS35結合活性を調べていたが、生理的な条件に近い状態で検定するために、動物細胞に発現させた受容体のＧタンパク質活性化能を、同時に発現させるナノビットＧタンパク質の会合状態から解離状態へ進む度合いをルシフェラーゼ輝度で検定するナノビット法によって検定する系を確立させる。
ETB受容体、Gi並びにG11三量体Gタンパク質、単鎖型抗体を混合して複合体を形成させ、単離を目指す。複合体は、電子顕微鏡による負染色像の観察によって評価する。複合体の形成効率が悪い場合は、ナノディスクによる受容体の安定化を試みる。複合体の安定性が不足する場合は、Gタンパク質アルファサブユニットのドミナントネガティブ変異の導入を試みる。単分散性のよい安定な複合体が単離できれば、クライオ電子顕微鏡観察に進む。
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Research Products
(1 results)
