2020 Fiscal Year Annual Research Report
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20H03216
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
西澤 知宏 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (80599077)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / 構造生物学 / 膜輸送体 / ポリアミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生理学的に重要な膜輸送体に関して、クライオ電子顕微鏡構造解析を行うことで、輸送サイクルにおける複雑な動的構造変化を明らかにすることを目的としている。ATP13A2は、老化に伴う神経変性疾患の原因遺伝子として特定されたが、その機能は長い間不明であった。近年になり、ATP13A2がリソソームにおけるポリアミン排出輸送体であることが明らかになり、このはたらきによって細胞内のポリアミン濃度を保ち、重金属などによる細胞毒性から細胞を守るはたらきを持つことがわかってきた。P型輸送体の多くは金属カチオンを輸送するのに対して、ATP13A2は主にスペルミンやスペルミジンのような線形のポリアミンを輸送することが知られており、基質のサイズ、形状ともに大きく異なることから、ATP13A2は独自の仕組みを持つことが予想されていた。ATP13A2の安定性評価、および界面活性剤、阻害剤の検討を行った。精製した試料に対して各種の阻害剤を添加した後に観察試料を作製し、クライオ電子顕微鏡による予備的な測定と単粒子構造解析プログラムRELIONによる解析によって評価した。その結果、AMPPCPなどのATPアナログにおける安定性が比較的高く、構造解析に適していることを見出した。一方でリン酸アナログであるAlF、BeFを添加した条件ではタンパク質の動きはいまだに大きく、安定性向上の効果が低いことが分かった。今後は、より阻害効果の高い条件を探索すると同時に、さらに大規模のデータ収集・解析を行うことで構造を明らかにすることを目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
2020年度は、P型輸送体の一つでポリアミン輸送体として同定されたP5-ATPaseの構造解析に向けた精製条件の検討等をおこなった。蛍光ゲルろ過法という手法を用いて、P5-ATPaseに属する輸送体の安定性を評価しところ、ヒトのもつATP13A2をGDNと呼ばれる界面活性化剤で可溶化すると、安定性が高く保つことができ、構造解析に適していることを見出した。また、構造解析を行う上で、いくつか阻害剤によってATP13A2の構造を安定化するために、それぞれの阻害剤の評価を行った。具体的には精製したATP13A2に対して、各種阻害剤を加えてしばらく経過した後に急速凍結を行いクライオ電子顕微鏡の観察試料グリッドを作製した。ATPアナログであるAMPPCP、およびその類似体であるAlF-ADPを加えた試料で予備的なデータ収集を行い、RELIONなどの単粒子構造解析プログラムによって解析を行ったところ、二次元平均化像でヘリックスなどの二次構造に由来する密度を観察することができた。しかしながら、Ab initioでの妥当な三次元像を作成することは難しく、構造解析には至らなかった。一方で、AlF、あるいはBeFといったようなリン酸アナログも同時に試したが、これらの阻害剤を加えた試料の撮影像からは、明確な二次構造を確認することができなかったことから、これらの阻害剤だけではATP13A2の動きは十分にとどめることができないことが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
AlFやBeFのリン酸アナログは、一般的にＰ型輸送体をE2Pと呼ばれる状態にとどめると考えられている。このE2Pは輸送基質に対する親和性が高い状態と考えられていることから、これらのリン酸アナログに加えて、基質であるスペルミン、スペルミジンなどを加えることで、よりタンパク質の安定性を向上させることができると考えられる。また、ATP13A2を含む、5型のP型輸送体は、PIP2などの脂質が結合することで特定の反応中間体にとどめられるという研究が報告されていることから、これらの脂質を加えてタンパク質の安定性を向上させたり、ナノディスクと呼ばれる疑似的な脂質二重膜にこれら特定の脂質を添加しながら再構成したりすることも試みる。また、単粒子解析においては、RELION以外のプログラムを使用することで、ab initioでの（データからの）三次元像作成を試みる。今回の結果から、タンパク質自体の動きがいまだに大きいことが、これらの解析処理を妨げる大きな要因であることが考えられるため、二次元クラス分けなどによって、より均質な構造を持つ粒子を選別することで、タンパク質の動きによる影響を抑えて、三次元像を作製することも試みる。
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