2021 Fiscal Year Annual Research Report
細胞膜張力と膜タンパク質機能の関連解明に向けた基盤実験技術の創成と応用
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20H03219
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
岩本 真幸 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40452122)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 生体膜 / チャネル / 張力 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究開始当初より開発を進めてきた膜張力実験プラットフォームにリアルタイム張力解析プログラムを組み合わせて進化させた。これにより、脂質二重膜（CBB）張力の常時モニター下で膜張力操作を行い、CBBに再構成したKcsAチャネルの応答を観測できるようになった。従来は実験後のデータ解析によって初めて膜張力値が明らかになっていたが、その場で望んだ通りの張力に制御できるようになり、実験効率が著しく向上した。また、脂質二重膜の片面ごとに張力を制御する非対称張力実験を行い、KcsAの張力依存性が細胞質側張力によってもたらされていることが明らかになった。KcsAの構造に与える非対称張力の影響を検証するために、テトラメチルローダミン（TMR）標識による蛍光測定実験を行った。この実験は、KcsAの特定部位に標識したTMRの蛍光強度がKcsAのゲート開閉に伴う構造変化によって変化することを利用したものである。TMR標識KcsAをリポソームに再構成し、直径の小さいリポソームを調製することで膜に非対称張力を発生させた。KcsAはリポソーム膜に細胞質側を外側に向けて組み込まれているので、上記リポソームではKcsAの細胞質側リーフレットの張力が大きくなる。蛍光測定の結果、小径（約30 nm）のリポソーム膜内ではTMR標識KcsAの蛍光強度が有意に変化しており、ゲート構造に対する細胞質側張力の影響を確認できた(Ueki, FEBS Lett., 2021)。TMR標識とリポソーム径制御による構造変化解析は、機能解析（電流測定）データをサポートできるので、今後変異体の解析を行う際にも活用したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜実験プラットフォームを初年度よりも進化させることができた。また、膜張力がタンパク質構造に及ぼす影響を解析する手法を確立させ、膜張力の作用を多面的捉えられる研究体制が整った。さらに、KcsAチャネルの膜張力感知機構に関し、上述の手法を応用することで新たな知見を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
膜張力実験プラットフォームの開発は概ね完了したので、今後はチャネル研究への応用可能性の実証に注力する。具体的には、KcsAチャネルが膜張力依存性を示す構造的要因を明らかにする。そのために複数種の変異体KcsAを作製し、膜張力のリアルタイム制御下で単一チャネル電流測定を行う。また、標識したTMRの蛍光強度から張力によるチャネル構造変化を検出する実験手法も活用し、膜張力作用を機能および構造の両面から捉える。
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