2021 Fiscal Year Annual Research Report
Study on Structure and Function for Force Generating Mechanism of Bacterial Flagellar Motor
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20H03220
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
本間 道夫 名古屋大学, 理学研究科, 研究員 (50209342)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | べん毛 / モーター / 生体エネルギー変換 / 膜タンパク質 / 分子構築 / タンパク質構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
べん毛回転は、細胞膜上の固定子中をイオンが透過し、固定子－回転子間の相互作用が変化し、回転力が生じる。この回転モデルに対して、回転子タンパク質FliGと固定子タンパク質PomA間の相互作用を同定して、固定子と回転子がギアのように噛むような相互作用によって回転力をつくるモデルを提案した。実際に固定子が回転しているかを検証する為に、GFPタンパク質をPomBに融合し、精製を行い、AFMによる観察を行った。しかしながら、固定子の構造を明確に観察することはできなかった。超好熱細菌AquifexのMotAではナノディスクへの再構成は成功し、構造解析のリファインメントを行い、論文にする為に、追加の確認実験を行った。ほぼ、論文は完成して投稿目前である。我々の研究で主に使っている海洋性ビブリオ菌のPomAPomBに関して、界面活性剤や変異体を用いて、クライオ電子顕微鏡による構造解析を行った。十分な数の固定子構造を選択することができ、原子レベルの構造構築とそのリファインメントを行った。さらにべん毛モーターの試験管内での再構成系構築をし、機能的なモーターを作る為には、精製した固定子とMSリングを膜に再構成する必要がある。MSリング構成タンパク質FliFは約60kDa二回膜貫通タンパク質で、約３０分子がMSリングに重合する。大腸菌内でビブリオ菌FliFを大量発現するとMSリングは形成されずに、約230kDaの可溶性複合体として精製されてくる。この精製FliFをリポソームに再構成することに成功し、リング形成の条件検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年に定年退職を迎えたが、名誉教授として研究員として働き、大学で以前と同様に仕事に従事し、これまでと同様に研究を進め、概ね順調に進展している。小嶋誠司教授の微生物運動グループに所属し、小嶋教授との共同研究としてサポートしてもらう一方、グループの学生にも研究を手伝ってもらうことができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
べん毛固定子のクライオ電子顕微鏡での構造解析を行い、本年度、超好熱性真正細菌A. aeolicus由来のMotAの五量体構造とビブリオ菌PomABの構造を明らかにしている。構造データのリファインメントと構造シミュレーションを行い、来年度中には論文にまとめる予定である。また、種々の変異体を作製することで、PomAPomB複合体の構造解析を行っている。しかし、PomBのペリプラズム領域の構造は、見えていない。ペリプラズム領域の欠損体を作製して、種々の界面活性剤をもちいることで、クライオ電子顕微鏡による構造を明らかにすることを目標とする。PomAPomB複合体は、膜に挿入されただけでは、イオン透過活性はない。PomBのプラグ領域と呼ばれる部分がPomAのペリプラズム領域のループ領域と相互作用することで、回転が阻害されることで、無駄なイオンの流れを抑えているというモデルを昨年度提案した。この活性化機構を明らかにする。サルモネラ菌のFliFを大腸菌において大量発現させると、膜中にMSリング構造を形成することが知られている。FliFは約60kDa二回膜貫通タンパク質で、約３０分子がリングに重合する。大量精製したMSリングとPomAPomB複合体をプロテアリポソームに再構成する実験を行う。モーターの完全再構成を将来の目標としていることからFliG/FliM/FliNからなるCリングの大腸菌内において大量発現する系の構築を行う。昨年度から引き続き計画していた、Cリングタンパク質の大量精製がおこなうことができれば、それらの結晶化も行う。十分な量のリング構造が得られた場合には、クライオ電子顕微鏡を用いた構造の解析も行いたい。
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