2020 Fiscal Year Annual Research Report
試験管内分子進化と立体構造解析に基づいた赤色蛍光タンパク質の系譜拡張
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20H03221
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今田 勝巳 大阪大学, 理学研究科, 教授 (40346143)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 蛍光タンパク質 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①サンゴ由来GFPのRFPへの変換
サンゴ由来GFPであるAzamiGreenを出発材料とし、変異導入によってRFP化を試みた。既存のRFPにおいて保存性が高く、AzamiGreenや他のGFPでは保存性が低いアミノ酸残基に着目し、AzamiGreen中のこれらの残基をRFP型のアミノ酸残基に置換した様々な変異体を作製した。そのうちの１つが弱い赤色蛍光を発しており、AzamiRed0.1とした。AzamiRed0.1はAzamiGreenから35アミノ酸が置換されていたが、その中には赤色蛍光には必要ない、あるいは不適切な変異も含まれていると予想された。そこで、それぞれのアミノ酸残基を元のAzamiGreenに置換した変異体を作製し、赤色蛍光が維持あるいは強化される変異体を作製した。この作業を繰り返すことで、最終的にAzamiGreenから29アミノ酸が置換された、明るい赤色蛍光を示すAzamiRed1.0の創出に成功した。AzamiRed1.0の量子収率は約 65%であった。
②AzamiRed1.0のＸ線結晶構造解析
AzamiRed1.0を結晶化し、SPring-8においてＸ線回折データを測定し、最終的に1.84オングストローム分解能で立体構造を決定した。全体の構造は既に報告されているAzamiGreenの立体構造と大きな差は無かったものの、蛍光団の向きやその周辺残基の側鎖のコンフォメーションに顕著な違いが観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ほぼ予定位通りに研究が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
①GFP由来RFPの単量体化：前年度に開発したGFP由来RFPは4量体であるため、タンパク質のイメージング用タグとしては不適当である。そこで、GFP由来RFPの4量体界面 に変異を導入することで、このタンパク質の単量体化を試みる。一般的に多量体のRFPは単量体化することで蛍光を失うことが知られているた め、単量体化した変異体に更に試験管内分子進化をおこなうことで、明るい単量体を得る。単量体化したGFP由来RFPを様々なタンパク質と融合 させて細胞イメージングをおこない、このタンパク質がイメージングタグとして十分利用できることを実証する。
②GFPをRFP化するために必要な最低限の変異の同定：前年度に開発したGFP由来RFPは、GFPに29アミノ酸変異が導入されたものである。これらの変異うちRFP化に必須なアミノ酸を同定することで、 GFPをRFP化するために必要な最低限のアミノ酸変異を同定する。
③異なるGFPのRFP化：前年度に開発したGFP由来RFPで導入した変異が他の生物種由来のGFPをRFP化出来るかを検証する。
④GFP由来RFPのX線結晶構造解析：前年度に開発したGFP由来RFPのX線結晶構造解析を進めるほか、上記①および②で新たに開発するタンパク質についてもX線結晶構造解析をおこ なう。
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