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2021 Fiscal Year Annual Research Report

試験管内分子進化と立体構造解析に基づいた赤色蛍光タンパク質の系譜拡張

Research Project

Project/Area Number 20H03221
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

今村 博臣  京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 今田 勝巳  大阪大学, 理学研究科, 教授 (40346143)
Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords蛍光タンパク質 / イメージング / X線結晶構造解析
Outline of Annual Research Achievements

前年度に開発したGFP由来RFPであるAzamiRed1.0は4量体であったため、タンパク質のイメージング用タグとしては不適当であると考えられた。そこで、AzamiRed1.0の4量体界面に変異を導入することで単量体化を試みたところ、単量体になった一方で蛍光が完全に失われてしまった。そこでこの単量体化変異体にランダム変異や部位特異的飽和変異導入を繰り返すことで赤色蛍光を回復させた。こうして得られた単量体化RFPであるmARs1を様々なタンパク質と融合させて動物細胞で発現させたところ、想定された細胞内局在を示した。このことから、mARs1はイメージングタグとして十分利用できる性能を有すると考えられた。
次に、AzamiRed1.0に導入された29アミノ酸の変異のうち、RFP化に必須なアミノ酸を同定することを試みた。29個の変異を一つ一つもとのアミノ酸に戻した結果、6アミノ酸変異だけ持つタンパク質でもGFP型蛍光団に混じり、僅かにRFP型蛍光団を持つことが示された。
AzamiGreenからAzamiRedへの変換で導入した29個のアミノ酸置換によって他のGFPもRFPに変えることができるかを検証した。その結果、AzamiGreenと82%の相同性を有するサンゴ由来GFPであるMcavGFPが変異導入によってRFPに変わることが見いだされた。このことは、上記の29アミノ酸変異はAzamiGreenだけに見られる特殊な変異ではなく、比較的配列の近いGFPをRFPに変えることができる普遍的な変異であることが示唆された。
最後に、AzamiGreenおよびAzamiRed1.0の変異体についてX線結晶構造解析を進め、AzamiGreenについては高分解能でのモデルの構築に成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ほぼ計画通りに研究が進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

① GFP由来RFPのX線結晶構造解析:これまでに開発したGFP由来RFPおよびその変異体のX線結晶構造解析を進め、RFP化に重要な構造変化を明らかにする。
② 異なるGFPのRFP化:これまでに得られた知見をもとに、他の生物種由来のGFPをRFP化できるかを検証する。
③ GFP由来RFPを用いた蛍光ツールの開発:これまでに開発したGFP由来RFPを用いて、新たな蛍光バイオセンサーを開発する。

  • Research Products

    (8 results)

All 2021

All Journal Article (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (7 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Lactate is an energy substrate for rodent cortical neurons and enhances their firing activity2021

    • Author(s)
      Karagiannis Anastassios、Gallopin Thierry、Lacroix Alexandre、Plaisier Fabrice、Piquet Juliette、Geoffroy H?l?ne、Hepp R?gine、Naud? J?r?mie、Le Gac Benjamin、Egger Richard、Lambolez Bertrand、Li Dongdong、Rossier Jean、Staiger Jochen F、Imamura Hiromi、Seino Susumu、Roeper Jochen、Cauli Bruno
    • Journal Title

      eLife

      Volume: 10 Pages: e71424

    • DOI

      10.7554/eLife.71424

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 緑色蛍光タンパク質由来赤色蛍光タンパク質の創出2021

    • Author(s)
      今村博臣、大坪史歩、竹川宣宏、今田勝巳
    • Organizer
      第21回日本蛋白質科学会年会
  • [Presentation] 緑色蛍光蛋白質AzamiGreen変異体における赤色蛍光発生の構造基盤2021

    • Author(s)
      大坪史歩、竹川宣宏、今村博臣、今田勝巳
    • Organizer
      第21回日本蛋白質科学会年会
  • [Presentation] 単一細胞ATP濃度イメージングによって明らかとなったアポトーシス細胞内ATP濃度のダイナミクスとその制御2021

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      第94回日本生化学会大会
    • Invited
  • [Presentation] 緑色蛍光蛋白質AzamiGreen由来赤色蛍光蛋白質の結晶構造解析に基づく赤色蛍光団形成の構造基盤2021

    • Author(s)
      大坪史歩、今村博臣、竹川宣宏、今田勝巳
    • Organizer
      第59回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 緑色蛍光蛋白質由来赤色蛍光蛋白質の開発2021

    • Author(s)
      今村博臣、大坪史歩、西田水穂、竹川宣宏、今田勝巳
    • Organizer
      第59回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] Imaging of ATP dynamics inside living and dying cells2021

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      第5回日本循環器学会基礎研究フォーラム
    • Invited
  • [Presentation] 緑色蛍光タンパク質から赤色蛍光タンパク質を創り出す2021

    • Author(s)
      今村博臣、大坪史歩、西田水穂、竹川宣宏、今田勝巳
    • Organizer
      日本生体エネルギー研究会第47回討論会

URL: 

Published: 2023-12-25  

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