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2020 Fiscal Year Annual Research Report

Measuring molecular properties of membrane proteins using a synthetic cell micro-environment conposed of a model cell membrane and a nanometric space

Research Project

Project/Area Number 20H03225
Research InstitutionKobe University

Principal Investigator

森垣 憲一  神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (10358179)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 林 文夫  神戸大学, 理学研究科, 名誉教授 (80093524)
鈴木 健一  岐阜大学, 高等研究院, 教授 (50423059)
笠井 倫志  京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (20447949)
Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords生体膜 / ラフト / 人工膜 / GPCR
Outline of Annual Research Achievements

細胞膜の微小ドメイン構造(ラフト)は、膜タンパク質の機能調節に重要な役割を果たすと考えられている。研究代表者は、ラフト領域と非ラフト領域が明確に分かれているパターン化人工膜を用いて、膜タンパク質のラフト親和性を定量する手法を開発した。本研究は、人工膜と接する厚さ100nm以下のナノ空間に、細胞内のような高濃度のタンパク質やリガンドが存在する微小環境を再現し、それらと膜タンパク質との結合・解離を1分子蛍光観察で定量的に評価することを目的とする。2020年度には、①人工膜とナノ空間を一体化したバイオチップ作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成、に関する技術開発を行った。
①人工膜とナノ空間を一体化したバイオチップ作製:人工膜としては、光重合性リン脂質を光リソグラフィー技術でUV重合することでポリマー脂質膜を作製した。ナノ空間は、厚さの制御された接着層(高密度な親水性高分子鎖(高分子ブラシ)を被覆したシリカ微粒子)を用いて人工膜とPDMSを結合することで作製した。粒径100 nmのナノ粒子を用いることで、流動性脂質膜部位の膜とPDMSの間に同程度の厚さを持つナノ空間が形成された。
②パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成:細胞由来の膜断片(blebs)を用いて、哺乳類細胞の膜タンパク質を人工膜に直接導入する技術を開発した。精神疾患に関わる重要なGPCRであるドーパミン受容体(D2R)をCHO細胞に発現し薬剤処理で膜断片を形成した。膜断片を導入する際の濃度を低く抑えることで、膜断片を平面膜化してD2Rが区画内で側方拡散していることを確認した。また、PDMSとの境界領域においては、区画内に多量のD2Rが導入され、分子が2次元拡散していることを確認した。また、D2Rが生理的な活性を持つことを二量体形成寿命、アンタゴニストの結合などで示すことができた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、人工膜と接する厚さ100nm以下のナノ空間に、細胞内のような高濃度のタンパク質やリガンドが存在する微小環境を再現し、それらと膜タンパク質との結合・解離を1分子蛍光観察で定量的に評価することを目的としている。2020年度には、①人工膜とナノ空間を一体化したバイオチップ作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成、に関する技術開発を行った。人工膜とナノ空間を一体化したバイオチップ作製では、光重合性リン脂質を光リソグラフィー技術でUV重合することでポリマー脂質膜を作製した。ナノ空間は、厚さの制御された接着層(高密度な親水性高分子鎖(高分子ブラシ)を被覆したシリカ微粒子)を用いて人工膜とPDMSを結合することで作製した。粒径100 nmのナノ粒子を用いることで、流動性脂質膜部位の膜とPDMSの間に同程度の厚さを持つナノ空間が形成された。パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成では、細胞由来の膜断片(blebs)を用いて、哺乳類細胞の膜タンパク質を人工膜に直接導入する技術を開発した。精神疾患に関わる重要なGPCRであるドーパミン受容体(D2R)をCHO細胞に発現し薬剤処理で膜断片を形成した。膜断片を導入する際の濃度を低く抑えることで、膜断片を平面膜化してD2Rが区画内で側方拡散していることを確認した。また、PDMSとの境界領域においては、区画内に多量のD2Rが導入され、分子が2次元拡散していることを確認した。また、D2Rが生理的な活性を持つことを二量体形成寿命、アンタゴニストの結合などで示すことができた。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、以下の検討を行うことでパターン化人工膜およびナノ空間を作製し、膜タンパク質の分子物性を定量的に評価する技術を開発したい。
①人工膜とナノ空間を一体化したバイオチップ作製:これまでの検討からナノ空間を作製することが可能になった。一方、ナノ空間の厚さや内部での分子拡散はまだ道である。今年度は、シリカ微粒子の粒径を変えてナノ空間の厚さを制御し、ナノ空間での分子の側方拡散速度が厚さによってどのように制御されるかを検証する。
②パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成:昨年度には、PDMSとパターン化人工膜の界面において細胞由来の膜断片(blebs)から多くの膜タンパク質が導入されていることを確認した。今年度は、この研究成果を発展させて、厚さの制御された空間での再構成を行う。ナノギャップ構造を用いてPDMSとパターン化人工膜との距離を制御し、膜タンパク質導入機構を解明し、多量の膜タンパク質を高感度に検出する方法論を確立する。
③膜タンパク質のラフト親和性測定:ナノ空間を組み合わせた人工膜において、再構成された膜タンパク質のうち、膜内側方拡散により観察部位に移動できる分子のみを選択的に観察する。膜タンパク質としては、既に人工膜でラフト親和性の定量がなされているRhを用いて、視細胞由来の膜断片からRh分子を再構成し、lo相・ld相での存在確率からラフト親和性を定量する。また、D2Rについてもラフト親和性を定量する。

  • Research Products

    (25 results)

All 2021 2020 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (11 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 11 results,  Open Access: 3 results) Presentation (11 results) (of which Invited: 6 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] Weill Cornell Medicine(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      Weill Cornell Medicine
  • [Journal Article] Substrate-supported model membrane as a versatile analytical/ biosensing platform2021

    • Author(s)
      Morigaki Kenichi
    • Journal Title

      Analytical Sciences

      Volume: 37 Pages: 683~689

    • DOI

      10.2116/analsci.20SCR10

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Patterned Model Biological Membrane Composed of Polymerizable and Natural Lipids for Reconstituting the Membrane Functions2021

    • Author(s)
      Morigaki Kenichi
    • Journal Title

      MEMBRANE

      Volume: 46 Pages: 65~70

    • DOI

      10.5360/membrane.46.65

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Model Lipid Membranes Assembled from Natural Plant Thylakoids into 2D Microarray Patterns as a Platform to Assess the Organization and Photophysics of Light‐Harvesting Proteins2021

    • Author(s)
      Meredith Sophie A.、Yoneda Takuro、Hancock Ashley M.、Connell Simon D.、Evans Stephen D.、Morigaki Kenichi、Adams Peter G.
    • Journal Title

      Small

      Volume: 17 Pages: 2006608~2006608

    • DOI

      10.1002/smll.202006608

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Photosynthetic Model Membranes of Natural Plant Thylakoid Embedded in a Patterned Polymeric Lipid Bilayer2020

    • Author(s)
      Yoneda Takuro、Tanimoto Yasushi、Takagi Daisuke、Morigaki Kenichi
    • Journal Title

      Langmuir

      Volume: 36 Pages: 5863~5871

    • DOI

      10.1021/acs.langmuir.0c00613

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The effects of phospholipids and fatty acids on the oligomer formation of NAP-222020

    • Author(s)
      Odagaki Sin-Ichi、Maekawa Shohei、Hayashi Fumio、Suzaki Toshinobu、Morigaki Kenichi
    • Journal Title

      Neuroscience Letters

      Volume: 736 Pages: 135288~135288

    • DOI

      10.1016/j.neulet.2020.135288

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] New lipid membrane technologies for reconstitution, analysis, and utilization of ‘living’ membrane proteins2020

    • Author(s)
      Yasuhara Kazuma、Morigaki Kenichi
    • Journal Title

      Biophysics and Physicobiology

      Volume: 17 Pages: 125~129

    • DOI

      10.2142/biophysico.BSJ-2020021

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] One-Pot Construction of Multicomponent Supramolecular Materials Comprising Self-Sorted Supramolecular Architectures of DNA and Semi-Artificial Glycopeptides2020

    • Author(s)
      Higashi Sayuri L.、Hirosawa Koichiro M.、Suzuki Kenichi G. N.、Matsuura Kazunori、Ikeda Masato
    • Journal Title

      ACS Applied Bio Materials

      Volume: 3 Pages: 9082~9092

    • DOI

      10.1021/acsabm.0c01316

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] High-speed single-molecule imaging reveals signal transduction by induced transbilayer raft phases2020

    • Author(s)
      Koyama-Honda Ikuko、Fujiwara Takahiro K.、Kasai Rinshi S.、Suzuki Kenichi G.N.、Kajikawa Eriko、Tsuboi Hisae、Tsunoyama Taka A.、Kusumi Akihiro
    • Journal Title

      Journal of Cell Biology

      Volume: 219 Pages: e202006125

    • DOI

      10.1083/jcb.202006125

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Development of Fluorescent Ganglioside GD3 and GQ1b Analogs for Elucidation of Raft-Associated Interactions2020

    • Author(s)
      Konishi Miku、Komura Naoko、Hirose Yuya、Suganuma Yuki、Tanaka Hide-Nori、Imamura Akihiro、Ishida Hideharu、Suzuki Kenichi G. N.、Ando Hiromune
    • Journal Title

      The Journal of Organic Chemistry

      Volume: 85 Pages: 15998~16013

    • DOI

      10.1021/acs.joc.0c01493

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Synergetic Roles of Formyl Peptide Receptor 1 Oligomerization in Ligand-Induced Signal Transduction2020

    • Author(s)
      Nishiguchi Tomoki、Yoshimura Hideaki、Kasai Rinshi S.、Fujiwara Takahiro K.、Ozawa Takeaki
    • Journal Title

      ACS Chemical Biology

      Volume: 15 Pages: 2577~2587

    • DOI

      10.1021/acschembio.0c00631

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A synthetic ion channel with anisotropic ligand response2020

    • Author(s)
      Muraoka Takahiro、Noguchi Daiki、Kasai Rinshi S.、Sato Kohei、Sasaki Ryo、Tabata Kazuhito V.、Ekimoto Toru、Ikeguchi Mitsunori、Kamagata Kiyoto、Hoshino Norihisa、Noji Hiroyuki、Akutagawa Tomoyuki、Ichimura Kazuaki、Kinbara Kazushi
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 11 Pages: 2924

    • DOI

      10.1038/s41467-020-16770-z

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 人工膜とナノ空間を用いた細胞膜構造の再構成と機能解析2021

    • Author(s)
      森垣 憲一
    • Organizer
      日本化学会 第101春季年会
    • Invited
  • [Presentation] 高精度1分子観察によるラフト組織化と機能の解明2021

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      生物工学・脂質駆動学術産業創生研究部会
    • Invited
  • [Presentation] アミロイド線維形成とリン脂質二分子膜破壊との関係性の解明2020

    • Author(s)
      高山 宙輝, 曲師 香緒里, 森垣 憲一, 茶谷 絵理
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 基準振動解析を用いたロドプシンの動態予測と機能の連関2020

    • Author(s)
      金重 先人, 藤井 雅史, 林 文夫, 森垣 憲一, 山下 隼人, 粟津 暁紀
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 高速AFMによるロドプシンクラスター上トランスデューシン動的過程の観察2020

    • Author(s)
      干鰯谷 和彦, 山下 隼人, 林 文夫, 森垣 憲一 , 藤井 雅史, 粟津 暁紀, 阿部 真之
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 脂質二分子膜に働く光捕捉力の検証2020

    • Author(s)
      石原 悠人, 岸本 龍典, 杭田 芙子, 工藤 卓, 森垣 憲一, 細川 千絵
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 高精度1分子で明らかになったラフト組織化と機能2020

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      分子夾雑化学東海地区シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] Raft organization and function as revealed by single-molecule imaging2020

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
    • Invited
  • [Presentation] エクソソーム膜動態の超解像・1分子可視化解析2020

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Organizer
      日本分析化学会第69年会
    • Invited
  • [Presentation] 蛍光1分子観察法による細胞膜中の分子の動態と機能の解明:会合体形成とダイナミクス2020

    • Author(s)
      笠井倫志
    • Organizer
      日本化学会秋季事業 第10会 CSJ化学フェスタ2020
    • Invited
  • [Presentation] Single molecule observation of adhesion GPCR accumulated at the cell-cell interface2020

    • Author(s)
      Kasai RS, Nemoto YL.
    • Organizer
      第58回日本生物物理学会年会
  • [Book] 膜タンパク質工学ハンドブック2020

    • Author(s)
      鈴木健一
    • Total Pages
      537
    • Publisher
      エヌ・ティー・エス
  • [Remarks] Morigaki Group

    • URL

      http://www2.kobe-u.ac.jp/~morigaki/

URL: 

Published: 2021-12-27  

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