2021 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment and dynamics of the centromere chromatin, which ensure the faithful genome inheritance
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20H03236
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堀 哲也 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (70550078)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | クロマチン / ゲノム / 染色体 / セントロメア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞内におけるセントロメアクロマチンの構造をヌクレオソーム単位で解析し、これまで未解明であった細胞周期に依存したクロマチン構造の変化を基盤としたセントロメア機能を制御する仕組みと、クロマチン構造変換の生物学的な意義の解明を目指している。令和3年度において、以下2つの項目について研究を行なった。
CENP-A導入に必要な、１）セントロメアクロマチン構造の解析のための実験系の構築、２）遺伝学を利用したセントロメアクロマチン構築の分子メカニズムの解析、を行った。
１）CENP-A導入が活性化されるG1期の細胞集団を、既に構築した微小管形成阻害剤及び、M期チェックポイントの制御因子の阻害剤を利用する実験により濃縮を行った。この時、同時にCENP-A導入に必須な各種因子のノックアウトを行い、CENP-A導入活性に異常を示す各種状況下のG1期の細胞集団を得る実験系を構築した。各種の因子の条件的ノックアウトは、オーキシン誘導系を適用した。また、LacO-LacIシステムにより、染色体の任意の箇所にCENP-A導入に関与する因子を異所局在させる実験系を適用し、様々なクロマチン状況下でCENP-Aの導入が生じる実験系を構築した。
２）CENP-A導入が何故、細胞周期のG1期に生じるのか、その制御の仕組みの理解を目指し、CENP-Aのシャペロンタンパク質であるHJURPに着目して、遺伝学的な手法により、HJURPのセントロメア局在性を制御するアミノ酸配列の同定を行った。また、CENP-Aの導入に必須なセントロメアクロマチン構築因子の欠損変異細胞を用いた細胞生物学的な解析を行い、これら因子を含む複合体を介したHJURPのセントロメア局在性の制御を示唆する結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究期間中に明らかにする点として「セントロメア機能を制御する仕組みにおける、細胞周期に依存したクロマチン構造の変化とその生物学的な意義」の解明を挙げた。この研究目標に関連して、これまで、複数の薬剤を用いた細胞周期の同調法を適用し、ニワトリDT40細胞におけるCENP-Aの取り込み時期の特定と、その特定時期の細胞集団を回収する方法を確立した。さらに、セントロメアのクロマチン構築に重要であると考えられているCENP-Aの導入について、この過程に必須な複数の因子の条件的欠損変異細胞の構築を行った。これら欠損変異細胞を用いて、上記の細胞周期同調法を組み合わせることで、様々な条件下の細胞集団を得る方法は、研究目標であるセントロメアのクロマチン構造の変化とその意義の解明に向けた必須な実験系となる。また、並行して行なった解析により、CENP-A特有なシャペロンタンパク質HJURPについて、「G1期に限定的にセントロメアへの局在を示す仕組み」に関連するアミノ酸残基を見出した。さらに、セントロメアクロマチンの構築に関与する因子が、HJURPのセントロメア局在活性を制御する仕組みを示唆する結果を得た。これら知見の分子レベルの仕組みは不明であるが、研究目標であるセントロメアのクロマチン構造の変化とその意義の解明に寄与する重要な発見である。以上の理由により、概ね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度に行った１）セントロメアクロマチンの構造の解析のための実験系の構築、２）セントロメアクロマチン構築に関与するメカニズムに関する知見を踏まえて、以下2項目について推進する。
１）セントロメアクロマチンの高次構造の解析
令和3年度に樹立した、オーキシン誘導型の各種の条件的欠損変異細胞あるいはLacO-LacIシステムによる異所局在化を行った細胞を用い、特定の細胞周期に濃縮した細胞集団を得る。これら細胞集団に対して、ATAC-seq法およびHi-CO法を行ない、セントロメアクロマチンの凝縮度とヌクレオソーム配置を解析する。具体的には、M期とG1期の細胞集団の取得は、令和２年度に確立した方法を適用し、セントロメア関連因子の欠損下、あるいは異所的なCENP-Aの導入下のクロマチンの構造を正常細胞のセントロメアと比較解析し、セントロメア領域のクロマチン構造のモデル化を行なう。
２）セントロメアクロマチン構築の分子メカニズムの解明
令和3年度に発見したHJURPのセントロメア局在性に関与するアミノ酸を対象に、各種のアミノ酸変異を導入し、細胞生物学的および生化学的な解析を行い、タンパク質の修飾の有無およびタンパク質間の相互作用を中心に調べる。また、令和3年度に見出した、セントロメアクロマチンの構築に関与する因子とHJURPのセントロメア局在の制御について、細胞遺伝学的な解析および構造生物学的な解析を行い、その分子レベルの制御メカニズムについて調べる。
以上の解析結果を統合的に分析し、セントロメアに特異的なクロマチン構造の形成を制御する分子メカニズムとセントロメア機能との関連について明らかにする。ATAC-seq及びHi-CO法の次世代シーケンサーによる解析および情報解析は、国立遺伝学研究所の豊田敦特任教授、池尾一穂准教授および京都大学の谷口雄一博士の協力を仰ぐ計画である。
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