2021 Fiscal Year Annual Research Report
Study on the intracellular amino acid-sensing mechanism in the yeast TORC1 pathway
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20H03251
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
前田 達哉 浜松医科大学, 医学部, 教授 (90280627)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / TOR / TORC1 / グルタミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に投稿した、Pib2自体がグルタミンセンサーであり、かつTORC1を直接活性化する活性化因子でもあることを示した論文が、数度にわたる再投稿と追加実験を経て国際学術雑誌に受理された。
1）Pib2のグルタミン検知機構の解明：全長にわたって天然変性領域が存在することによるPib2の不溶化を克服するために作成したKog1-Pib2融合タンパク質を用いて、グルタミン応答能を保持した可溶性TORC1-Pib2複合体を酵母細胞から調製する方法を確立した。この標品を用いて、グルタミンに依存した構造変化を化学的架橋法により明らかにするための条件を検討した。架橋後の標品をトリプシン消化後、質量分析に供したが、さまざまな部分架橋産物が存在することによると考えられる感度の低下が観測された。
2）Pib2によるTORC1活性化機構の解明：上記と同じく可溶性TORC1-Pib2複合体標品を用い、in vivo部位特異的光架橋法を用いて、Pib2側とTORC1側の相互作用部位の探索を試みたが、アンバーコドンを利用した光反応性非天然アミノ酸導入法を用いたために複合体の発現が低下し、十分な感度を得ることができなかった。
3）Gtr依存的TORC1活性化機構の解明：不活性化型Gtr変異体の抑圧変異としてGtr依存的制御を受けないTORC1変異体を単離をこころみたところ、得られた候補はGtrによる制御とは無関係にTORC1活性が亢進した変異体であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
組換えPib2タンパク質が不溶化して生化学的実験が困難であることを、Kog1-Pib2融合タンパク質を利用することで克服しようとしたが、このことに伴って大腸菌を用いた大量発現系を利用することができなくなり、当初に予定していた感度を達成することが困難になったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
大量培養等を用いて生化学的実験に用いる標品の収量の向上に努めるとともに、質量分析などを活用して解析感度の向上を図る。また、遺伝学的解析からのモデル構築の比重を高め、困難な生化学的実験を補完できるようにする。
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