2021 Fiscal Year Annual Research Report
ミトコンドリア外シグナルによるミトコンドリア品質管理の制御機構
| Project/Area Number |
20H03257
|
|---|
| Research Institution | Rikkyo University |
|---|
Principal Investigator |
岡 敏彦 立教大学, 理学部, 教授 (40263321)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | ミトコンドリア |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアは多彩な細胞機能を担っており，その機能は細胞により様々な調節を受けている。特に，オートファジーを介した障害を受けたミトコンドリアの排斥は，ミトコンドリア品質管理として，近年，その詳細な分子メカニズムが明らかになってきた。私達は，PINK1/Parkinを介したミトコンドリアの品質管理が，cAMP/PKA経路によるリン酸化修飾で調節されることを証明した。これにより，様々なミトコンドリア外のシグナル経路が品質管理を調節する可能性が示された。本研究では，ミトコンドリア外シグナルによるミトコンドリア品質管理調節機構の分子メカニズムの全体像の理解を目指す。令和３年度は，次の２点について研究を進めた。
１．ミトコンドリア外膜上におけるヘキソキナーゼの機能を解析するために，３種類のアイソフォーム(HK1, HK2, HK4)を用いて，その酵素活性と細胞内局在の関連性を蛍光抗体法により解析した結果，HK1はミトコンドリアに，HK4は細胞質に，HK2はミトコンドリアと細胞質に局在することが明らかとなった。さらに，酵素活性を失ったHK2変異体は，ミトコンドリア局在を示さなかったことから，酵素活性に依存したミトコンドリアへの標的化機構が示唆された。
２．ヘキソキナーゼアイソフォームHK2のタンパク質複合体の形成に関わる因子を検索するために，ミトコンドリアの脱分極に依存してヘキソキナーゼに結合するタンパク質の同定を試みたが，まだ特異的なタンパク室の同定には至っていない。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．ヒトには４種類のヘキソキナーゼアイソフォーム（HK1, HK2, HK3, HK4)をコードする遺伝子が存在する。これまでの研究から，ヘキソキナーゼはアイソフォームごとに細胞内局在が異なることが報告されている。ヘキソキナーゼは解糖系の初発酵素として知られているが，私達はミトコンドリアの品質管理に働くことをすでに見出している。そこで，ミトコンドリア外膜上におけるヘキソキナーゼの機能を解析するために，３種類のアイソフォーム(HK1, HK2, HK4)を用いて，その酵素活性と細胞内局在の関連性を蛍光抗体法により解析した。その結果，HK1はミトコンドリアに，HK4は細胞質に，HK2はミトコンドリアと細胞質に局在することが明らかとなった。さらに，HK2の２つの酵素活性部位に変異を導入した変異体では，ミトコンドリア局在が失われたことから，酵素活性に依存したミトコンドリアへの標的化機構が示唆された。
２．障害を受けたミトコンドリアの外膜上で，HK2はPINK1と共にタンパク質複合体を形成するだけでなく，HK2自身も異なる大きさのタンパク質複合体を形成できる。HK2のタンパク質複合体の形成に関わる因子を検索するために，脱分極剤依存にヘキソキナーゼに結合するタンパク質の同定を試みたが，特異的な因子を見出すことは出来ていない。これは，多くのHK2は細胞質に存在するため，HK2とミトコンドリア外膜上で特異的に結合するタンパク質は相対的に微量になると考えられ，その検出が難しくなることが理由の一つと推定される。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１．２つのヘキソキナーゼアイソフォーム（HK1, HK2）は，分子内で繰り返し構造を持っており，酵素活性部位を２つ持っている。HK2の２つの酵素活性部位を不活化した変異体ではミトコンドリアへの標的化が失われていたため，２つの酵素活性部位のどちらが，またはどちらも必要なのかを個別に酵素活性部位に変異を導入し検証する。さらに，HK2と全長で高い相同性を示すHK1は，ミトコンドリアのみに局在するため，その細胞内局在への酵素活性部位の寄与や，HK1とHK2のキメラ変異体を用いたミトコンドリア局在に働くドメインの同定を進める予定である。
２．HK2のタンパク質複合体の形成に関わる因子を再検索するために，PINK1に結合する因子群の中から候補タンパク質を選び，既に樹立しているヘキソキナーゼにFLAGタグを付加したHK2-3FLAGを恒常的に発現するHeLa細胞をもちいて，免疫沈降を行うことで，HK2との相互作用を検証する。その後に，タンパク質複合体に含まれるかをNative-PAGEを用いて検討する。
|
