The overlooked diversity of the marine microbiome - Exploring the prokaryotic microbiome within eukaryotic microorganisms

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03305
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 中山 卓郎 筑波大学, 計算科学研究センター, 助教 (70583508)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 矢吹 彬憲 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 地球環境部門(海洋生物環境影響研究センター), グループリーダー (20711104) ; 野村 真未 山形大学, 理学部, 助教 (40770342)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 微生物多様性 / 原生生物 / 共生 / メタバーコーディング / ゲノム解析

Outline of Annual Research Achievements

本年度では主に、真核生物に共生する原核生物のゲノム解析および環境DNAのメタバーコーディング解析を進めた。下記にそれぞれの実績を示す。
[真核生物に共生する原核生物のゲノム解析] 前年度までに、静岡県下田沖において原核生物を共生させる真核微生物を採集し、Ornithocercus属渦鞭毛藻3種、Histioneis属渦鞭毛藻2種、Citharistes属渦鞭毛藻1種の共生シアノバクテリアについてゲノム増幅およびIlluminaシーケンサーによるショートリード配列の取得を行っていた。本年度では、より品質の高いゲノム情報を再構築するためOxford Nanopore社シーケンサーによるロングリード配列の取得を行った。上記の渦鞭毛藻のうちOrnithocercus属渦鞭毛藻1種を除く5種の渦鞭毛藻に見られる、計8種類の共生シアノバクテリアのロングリード配列取得に成功し、それぞれ高品質なシアノバクテリアドラフトゲノムが得られた。特にCitharistes属渦鞭毛藻共生シアノバクテリアについては環状のゲノムが再構築されたことから完全なゲノム情報が得られたと考えられる。今後得られたゲノムについては構造アノテーションおよびタンパク質の機能アノテーションを行い、比較ゲノム解析を進める予定である。
[メタバーコーディング解析] 前年度までに、静岡県下田近海の各地点で得られた海水サンプル10Lを0.45μm, 5 μm, 20μm,の網目のナイロンメッシュフィルターで濾過し、濾過後のフィルターからそれぞれDNA抽出を行っていた。本年度はこれらの抽出DNAを用いて、シアノバクテリアの16SrDNA特異的なPCRプライマーによる配列増幅およびPacBioシーケンサーによる配列決定を行った。その結果3区画の環境DNAから合計約40,000の16SrDNA部分配列（1kbp）を取得した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度においてゲノム解析およびメタバーコード解析に必要なデータの取得が完了した。今後はこれらのデータを用いた解析の段階に移行する。一部遅れが見られるものの全体としては順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

今後も当初の研究計画に則って研究を遂行する。真核生物に共生する原核生物のゲノム解析においては、本年度までに解読が完了した共生性と考えられるシアノバクテリアのゲノムをすでに明らかとなっている自由生活性のシアノバクテリアゲノムを比較解析することでその特徴を明らかにする。
メタバーコーディング解析においては、今回得られたメタバーコード配列を自由生活性シアノバクテリアのリボソームRNA遺伝子配列とともに分子系統解析を実施する。得られた系統樹から、真核生物画分に特異的に見られるシアノバクテリアの多様性が検出できるか検討する。