2020 Fiscal Year Annual Research Report
珪藻のウイルス弱毒化因子は，珪藻個体群の維持システムとして機能するのか？
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20H03327
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| Research Institution | Saga University |
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Principal Investigator |
木村 圭 佐賀大学, 農学部, 准教授 (30612676)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長里 千香子 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (00374710)
和田 啓 宮崎大学, 医学部, 准教授 (80379304)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 珪藻 / ウイルス / 弱毒化因子 / ウイルス生理学 / ウイルス生態学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「海の牧草」と称され、海洋資源生物として重要な『珪藻』は、常に強毒ウイルスによる死滅の危機に曝されている。ところが我々研究チームは、珪藻に感染する強毒ウイルスの働きを抑える『弱毒化因子』を発見した。この弱毒化因子は、珪藻 vs 強毒ウイルスの関係性に関与して、珪藻細胞内での強毒ウイルス複製を抑制すると考えられる。さらに、強毒ウイルス蔓延を抑え、珪藻個体群が生残する生態システムの一つとして機能している可能性も考えられる。本研究では、地球上で巨大生産力を誇る珪藻が、強毒ウイルス感染による死滅から回避する戦略の一端として、この弱毒化因子が関与しているのかを生理生態学的に理解することが目的である。
令和２年度は、弱毒化因子の関与によって、珪藻 vs 強毒ウイルスの関係に生じる変化（課題１：形質・発現遺伝子の変化、課題２：構造・形態の変化）を室内実験で解明することに主に取り組んだ。強毒ウイルス株に混在する弱毒化因子を探索するための約100,000通りに及ぶ感染試験を実施した。その結果、特に興味深いことに、RNAタイプの強毒ウイルスでは、他宿主種感染をすること、同宿主内の株間で感染パターンが異なることを見出し、感染可否はウイルス宿主の種ではなく別の因子で決まっていることを示唆した。また、今後研究で使用する強毒ウイルスのを特異的に認識する抗体を、人工合成したSS12-43V-HVカプシドタンパク質から作成し、高い力価を持つ抗体を取得した。また、シンクロトロン光照射によるウイルス感受性変異株取得を実施し珪藻C. tenuissimus NIES-3714株の強毒ウイルスCtenDNA virus type-II抵抗性候補株であるCten 2-6-SL-D2VR株を確立した。
なお、令和２年度では、成果に基づいて国内学会発表（日本藻類学会１件）を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
強毒ウイルスに混在する弱毒化因子探索のため、珪藻ウイルスコレクションから探索を試みた。珪藻保有株200株以上とウイルス株約500株の約100,000通りに及ぶ感染試験を実施している。一方で感染試験の結果、RNAタイプの強毒ウイルスで、他宿主種感染をすること、同宿主内の株間で感染パターンが異なることを見出し、感染可否はウイルス宿主の種ではなく別の因子で決まっていることを示唆した。
課題２では、今後研究で使用する強毒ウイルスのSS12-43V-HVを特異的に認識する抗体を作製した。カプシドタンパク質遺伝子配列を大腸菌のコドンユーセージに合わせて最適化し、遺伝子を全合成した。合成した遺伝子を発現用ベクターに組み込み発現用大腸菌に導入した。さまざまな発現条件（温度、発現誘導タイミング、誘導剤濃度、シャペロン共発現など）を試みた結果、SS12-43V-HVカプシドタンパク質を得、さらに精製することで高純度のSS12-43V-HVプシドタンパク質を得ることができた。得られたタンパク質を抗原としてウサギに投与して血清を得た。ELISAによる評価において、得られたポリクローナル抗体は高い力価を持つことが分かった。
また、シンクロトロン光照射によるウイルス感受性変異株取得も実施した。照射後の珪藻C. tenuissimus NIES-3714株、3715株に、珪藻強毒ウイルスのCtenDNA virus type-IIを接種し、約２週間培養したところ、培養プレート中で１つのウェルのみにウイルスによる死滅後に生残してきたコロニーが確認された。これをウイルス抵抗性能獲得候補株として分離し、形質が安定するまで継代培養を試みた。現在までに、安定して継代できることが判明しており、この株を、Cten 2-6-SL-D2VR株と命名し、ウイルス抵抗性能獲得候補株として確立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和３年度は、昨年度から実施している、強毒ウイルス、弱毒化因子のタンパク質の大量に培養から、密度勾配遠心分離法等で両因子を単離精製することを試みる。得られたこれらの粒子は、条件検討を繰り返して得られた結晶を、Ｘ線結晶構造解析に供し、大型放射光施設によって両因子の粒子タンパク質の構造を解明する。また、多数の感染試験から見出した、強毒ウイルスのみの株と弱毒化因子が存在する株を用い、それぞれを宿主珪藻細胞に感染させた時の、死細胞数、ウイルス複製等の経時変化を把握する。可能であれば、感染時の発現遺伝子解析も行い、弱毒化因子によって起こる、珪藻の生理的変化（ウイルス抵抗性等の生理変化）の解明を目指す。
また、昨年度より実施している、珪藻株約200株とウイルス株約500株の100,000通り以上に及ぶ感染試験による弱毒化因子コレクション化作業を進め、得られたこれらの因子のゲノム解析を実施する。ゲノムデータからこの因子がサテライトウイルスなのかを評価しつつ、この因子の多様性を評価する。さらに得られた配列情報に基づいたDNAマーカー作成を実施し、実際の現場サンプル（海水、底泥）から検出可能かを評価する。
今後研究で使用する弱毒化因子のSS12-43V-SVの合成タンパク質を作成し、このタンパク質を抗原として抗体を作成する予定である。また、昨年度までに作成した強毒ウイルス抗体と、この抗体が実際に両因子を認識するかをWestern Blottingで確認する。同時に、珪藻細胞内での両因子の感染動態（どこで、どのように複製されるのか）を、透過型電子顕微鏡の連続切片観察によって把握する。
他にも、昨年度に作出したウイルス感受性変異株のCten 2-6-SL-D2VR株に対して、強毒ウイルスの接種試験、ゲノム比較試験等を実施し、野生株との感染性状の比較を実施する。
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