2022 Fiscal Year Annual Research Report
珪藻のウイルス弱毒化因子は，珪藻個体群の維持システムとして機能するのか？
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20H03327
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| Research Institution | Saga University |
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Principal Investigator |
木村 圭 佐賀大学, 農学部, 准教授 (30612676)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長里 千香子 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (00374710)
和田 啓 宮崎大学, 医学部, 准教授 (80379304)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 珪藻 / ウイルス / 弱毒課因子 / ウイルス生理学 / ウイルス生態学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「海の牧草」と称され、海洋資源生物として重要な『珪藻』は、常に強毒ウイルスによる死滅の危機に曝されている。ところが我々研究チームは、珪藻に感染する強毒ウイルスの働きを抑える『弱毒化因子』を発見した。この弱毒化因子は、珪藻 vs 強毒ウイルスの関係性に関与して、珪藻細胞内での強毒ウイルス複製を抑制すると考えられる。さらに、強毒ウイルス蔓延を抑え、珪藻個体群が生残する生態システムの一つとして機能している可能性も考えられる。本研究では、地球上で巨大生産力を誇る珪藻が、強毒ウイルス感染による死滅から回避する戦略の一端として、この弱毒化因子が関与しているのかを生理生態学的に理解することが目的である。
令和４年度は、弱毒化因子の関与によって、珪藻 vs 強毒ウイルスの関係に生じる変化（課題１：形質・発現遺伝子の変化、課題２：構造・形態の変化）を室内実験で解明することに主に取り組んだ。強毒ウイルス株に混在する弱毒化因子について、弱毒化因子の高感度検出系であるnested PCRを用いて、どのように継代されるの等を実験を実施した。特に、弱毒化因子が培養液中に存在しうるのかどうかについて解析したところ、弱毒化因子株接種後から寿命による珪藻の死滅まで、培養液中に弱毒化因子が放出される量が極めて少ないことが明らかになった。弱毒化因子およびその株に含まれる強毒ウイルスの粒子径の測定をネガティブ染色による電子顕微鏡観察でおこなった結果、弱毒化因子の平均粒子径は強毒ウイルスのそれに比べて明らかに小さいことが示唆された。さらに、今後研究で使用する弱毒化因子を定量評価する定量PCR系の開発をおこなった。
なお、令和４年度では、成果に基づいて国内学会発表（日本プランクトン学会１件、日本藻類学会１件）を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までに、強毒DNAウイルス株の約１割に同じORFをもつ弱毒化因子DNA配列が存在することを確認している。これらの株について、弱毒化因子は継代できることに注目し、ウイルス同様、培養液中に粒子が放出されると予想した。そこで、接種後どのタイミングで培養液中から検出されるのかを調べた結果、培養後期で珪藻が死滅して以降に検出されると示唆される結果が得られた。一方で、接種後すぐには培養液中に放出されないことが明らかになった。これは強毒ウイルスが接種後すぐに培養液中に放出されるのとは異なっており、弱毒化因子が積極的に珪藻細胞を殺し、粒子が放出されるような感染過程を持たないことを示唆する結果であった。
一方で、培養液中に放出された粒子について、その直径を調査した。強毒ウイルス株である11-133V株、弱毒化因子含有株である12-43Vの培養上精を、0.2uｍ、0.1uｍで濾過し、フィルターを通過した画分を100kDa用限外濾過膜で濃縮し、ネガティブ染色法による電子顕微鏡観察を行った。その結果、強毒ウイルス株では直径25nm以上の粒子が主体であったが、弱毒化因子株では20nm以下の粒子が主体であることが判明した。これらの成果は、世界的にも本研究が初めて明らかにしたものであり、本研究の進捗が十分であることを示している。なお、ウイルス感染細胞の切片観察も行っており、強毒ウイルスが核で増殖することを明らかにした。
また課題１については、今後研究で使用する弱毒化因子の定量PCR系を作成するため、SS12-43V-SVのORF配列を対象としたqPCR系を開発した。他にも、昨年度までに、強毒ウイルスのカップシドの抗血清、弱毒化因子タンパク質の高血清を得ており、弱毒化因子の定量検出系の構築が進んでいる状況にある。これらの成果から、問題なく本課題が進捗していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
弱毒化因子の培地への放出タイミングが理解できたため、令和５年度は、弱毒化因子の粒子タンパク質の単離精製することを試みる。得られたこれらの粒子は、Ｘ線結晶構造解析に供し、大型放射光施設によって両因子の粒子タンパク質の構造を解明することを試みる。また、生理実験では弱毒化因子と強毒ウイルスの量的関係が理解できていないことから、開発した定量PCR系を駆使し、感染過程における弱毒化因子とウイルスの定量解析を実施する。強毒ウイルスのみの株と弱毒化因子が存在する株を用い、それぞれを宿主珪藻細胞に感染させた時の、死細胞数、ウイルス、弱毒化因子の量の経時変化を把握する。可能であれば、感染時の発現遺伝子解析も行い、弱毒化因子によって起こる、珪藻の生理的変化（ウイルス抵抗性等の生理変化）の解明を目指す。また定量PCR系を用い、実際の現場サンプル（海水、底泥）における強毒ウイルス、弱毒化因子の存在量を明らかにする。他に、強毒ウイルスと弱毒化因子の配列間比較を行うため、それぞれのサザンブロッティング系を開発し、両者の配列の±を評価し、どのような関係性にあるのかを明らかにする。
また珪藻細胞内において、弱毒化因子の感染動態（どこで、どのように複製されるのか）を、透過型電子顕微鏡の連続切片観察によって把握する。
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