2020 Fiscal Year Annual Research Report
Pharmacokinetic study on transporters in the xenobiotic detoxification among the liver, small intestine and kidney
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20H03401
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
楠原 洋之 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (00302612)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 和哉 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (00345258)
水野 忠快 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (90736050)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | オーファントランスポーター / メタボロミクス / 基質同定 / 薬物動態 / スフェロイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
基質が同定されていないオーファントランスポーターについて、血清代謝物のゲノムワイド関連解析ならびに遺伝子ノックアウトマウスのメタボロミクスを行い、薬物動態学における役割が不明なオーファントランスポーターの機能解明を目的として以下の研究を行った。ほ乳類細胞を用いた機能解析法が未報告であるSLC17A2について、ほ乳類細胞に過剰発現させた。SLC17A2はHepG2やMDCK細胞では細胞膜への局在が確認できた。MDCK細胞ではSLC17A2を過剰発現する安定発現細胞を樹立し、予備試験において薬物の細胞内蓄積量の増加が認められた。HEK293細胞では、Constitutive Active体と共発現させることで、細胞膜上でのSLC17A2の発現量増加を見出した。基質が同定されている他のトランスポーターに対しても発現量の増加に伴い輸送活性が増加することも確認でき、基質を同定する上で有用な条件である。SLC17A1~4クラスターノックアウトマウス（KO）を交配し、複数の系統を得、SLC17A1~4の発現量が低下している系統を複数確立した。さらに、2系統のマウス腎臓、野生型マウス腎臓とで、メタボローム解析を行った。野生型マウスに対して、細胞内蓄積量が増加するないし減少する代謝物を複数の得ることができた。マウス小腸の各部位（上部・中部・下部）よりcrypt領域を単離し、3Dスフェロイド培養することにより、未分化な小腸組織幹細胞の継代培養の条件を確立した。また、培地中に添加されている未分化性の維持に関わるWntシグナル関連物質を培地から除去、もしくは濃度を下げることによって、スフェロイドより単離した細胞をトランスウェルチャンバー上で培養することにより、小腸上皮細胞様細胞の単層膜を作る条件を確立し、排出トランスポーターP-gｐの機能を基質薬物の方向性輸送として観察することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、アフリカツメガエル卵母細胞を使用したin vitro輸送実験を想定していたが、当初予定していた研究協力者の実験室がコロナ禍で使用できなくなるなど遂行上の問題も生じたが、哺乳類細胞に一過的に強制発現させ、適した細胞を探索した結果、細胞膜に安定的に発現する細胞を樹立することに成功した。発現量を増加させる要因も見出し、哺乳類細胞を用いて基質の探索が可能となった。当該細胞を用いることで、基質の探索が進められると考える。また、クラスターノックアウトマウスを用いたメタボローム解析を行い、蓄積・減少する代謝物を複数検出されており、当初の仮説の従い、SLC17A1~4が尿への分泌の低下あるいは再吸収の低下等の動態変動を示唆する結果である。小腸では経細胞輸送評価のため、新規in vitroモデルとしてオルガノイドを経由する実験手法を確立するなど、薬物の消化管吸収機構の解明に貢献するモデルの構築も進められている。哺乳類細胞を宿主細胞とする安定発現細胞の樹立にリソースを割いたため、ミトコンドリア等細胞内オルガネラにおける薬物輸送機構の解明に向けた実験への着手が遅れているが挽回可能と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り、昨年度樹立した2種類の細胞（安定発現細胞と、CA体との共発現細胞（一過性発現））を用いて、in vitro試験により基質の探索を行う。その際にグルクロン酸抱合体や硫酸抱合体の基質を含めることで、トランスポーターと代謝酵素との機能連関を明らかにする。当該トランスポーターの重要性は、SLC17A1~4クラスターノックアウトマウスにおける体内動態解析により検証を行う。そのため、薬物の血漿中・尿中濃度、組織内濃度を定量するためのLC-MS/MS分析法を構築していく。この解析には、メタボローム解析の結果を含め、再現性やメタボローム解析では取得しなかった血漿や尿などの情報を取得し、遺伝子に欠損により生じる体内動態の変動を総合的に判断していく。
スフェロイドを経由することで、トランスウェルチャンバー上に小腸上皮細胞を樹立することい成功した。今後、薬物透過試験を実施し、本実験系が薬物輸送の機能評価に利用可能か検証していくとともに、樹立したマウス由来in vitroモデル構築も進めていく予定でいる。
細胞膜に加えて、オルガネラにおける薬物輸送機構として、ミトコンドリアに注目している。既報に従い、ミトンドリア精製法を樹立するとともに、ミトコンドリア内に蓄積する薬物量を評価するべく、過剰発現・ノックダウンを行い、細胞質とミトコンドリア間の薬物輸送を解析する手法を確立し、新たなトランスポーターの機能解明を行うことに取り組むことを計画している。
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