2021 Fiscal Year Annual Research Report

生活習慣病に伴う薬物動態変動を反映したバイオマーカーの定量的モデル解析

Research Project

Project/Area Number	20H03405
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	廣田豪九州大学, 大学病院, 副薬剤部長 (80423573)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	生活習慣病 / 糖尿病 / 薬物動態 / microRNA
Outline of Annual Research Achievements	これまでに薬物トランスポーターや薬物代謝酵素をはじめとする薬物動態関連遺伝子の発現量および活性が、糖尿病により変動することが指摘され、これらの変動は、薬物の体内動態に影響を与えることが報告されている。従って、糖尿病に起因する薬物動態関連遺伝子の発現量・活性の変化は、薬効の低下や副作用を誘発する恐れがあるため、糖尿病時の遺伝子発現変動機構を解明することは適切な薬物治療を行う上で重要であると考えられる。令和二年度までに、我々は高濃度のグルコース曝露により、肝がん由来HepG2細胞内の複数のmicroRNA（miRNA）の発現減少が引き起こされることを、miRNAマイクロアレイにより同定した。令和三年度においては、同定したmiRNAが薬物動態関連遺伝子に及ぼす影響について、詳細な機能解析を行った。当該miRNAは薬物トランスポーターの3’非翻訳領域に直接結合することで、発現制御を行うことが示唆され、タンパク質発現量への影響も確認した。発現制御が示された薬物トランスポーターは、糖尿病薬を輸送することが報告されている。このことから高血糖状態の肝臓におけるmiRNAの発現低下による薬物トランスポーターの発現の脱抑制は、薬物トランスポーターの発現上昇を引き起こすと考えられる。また、薬物トランスポーターの発現上昇は、肝臓からの糖尿病薬を含む基質薬物の排泄を促進させ、それら薬物の血中濃度に大きな影響を及ぼす可能性がある。miRNAの発現変動をバイオマーカーとした今後の検討は、適切な糖尿病の薬物治療の実施において重要となる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 前年度までに、高血糖時に薬物動態関連遺伝子の発現変動に寄与するmiRNAを特定するため、高血糖ならび低血糖で曝露したHepG2細胞を用いて、miRNAマイクロアレイを実施し、発現量が 2 倍以上変動するmiRNAを同定し、real time PCR法により発現変動を確認している。令和３年度は、これらmiRNAが影響を及ぼす薬物動態関連遺伝子を特定するために、データベース解析を行い、miRNAにより発現制御受ける薬物動態関連遺伝子の検討を行った。その結果、既存の報告には当該miRNAとの関連を示した薬物動態関連遺伝子は存在しなかったが、配列相同性解析により特定のmiRNAがヒト肝臓と腎臓に発現する薬物トランスポーターの3’非翻訳領域に直接結合することが示唆された。そこで、結合が示唆されたmiRNAをヒト肝がん由来HepG2細胞に移入し、ルシフェラーゼアッセイを行い、薬物トランスポーター遺伝子の3’非翻訳領域に対する作用を検討した。その結果、当該miRNAは遺伝子機能を抑制することが示され、western blottingにおいても、miRNAは薬物トランスポーターのタンパク質発現を抑制する結果を得た。これらの結果より、高血糖で発現が低下するmiRNAは、薬物トランスポーターの発現制御に寄与することが示唆された。ここまでの結果から、本研究は概ね研究計画のとおりに進捗していると考えられる。次年度以降は、薬物トランスポーターの基質薬物輸送能への影響を評価するとともに、血中のexosome内のmiRNA量を定量することで、予定されている臨床試験での薬物動態との関連解析に繋げていく予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後は、令和三年度に薬物トランスポーターへの発現制御を明らかにしたmiRNAについて、薬物輸送能への影響評価を行うとともに、高血糖時の薬物動態予測バイオマーカーとするための検討を進める計画である。具体的には、薬物輸送試験は、transwellを用いた細胞単層膜による薬物透過能を測定することで実施する。バイオマーカーとしての安定性を評価するために、培養液の循環式デバイスを用いた高血糖曝露状態を維持したin vitro試験を実施し、miRNAと薬物トランスポーターの発現の経時的変動を測定する。変動した薬物動態を予測するバイオマーカー確立のための臨床試験は、患者の循環血中のexosome内miRNAを定量することで実施する予定である。そのため、臨床試験の予備的実験として、同循環式デバイスを用いて、細胞から分泌されたexosomeを分取し、当該exosome内のmiRNAを定量することで、細胞内のmiRNA発現変動をexosome内miRNA量により捕捉できているのかについて、検討する計画である。我々はこれまでに、循環血中exosome内のmiRNAの定量を行う臨床試験を実施した経験があるため（Sci Rep. 2016; 6: 32299）、循環式デバイスによるmiRNA発現変動の検出を実施する上で障害はないと考える。高血糖により細胞内で変動したmiRNAについてexosomeを試料とした検出により確認することで、研究目的である糖尿病時の薬物動態変動を反映したバイオマーカーの確立のための臨床試験を実施できると考えている。