2021 Fiscal Year Annual Research Report
Nano-level transformation of the fine arrangement of synaptic molecules elicited by learning and environmental changes
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20H03427
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
廣瀬 謙造 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (00292730)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | シナプス / 超解像顕微鏡法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス脳凍結切片でのシナプス分子局在の可視化解析プラットフォームの確立
マウス脳の各部位でのシナプス分子について、確立的光学再構築顕微鏡法（STORM法）を用いた可視化解析を行うために、マウス脳の凍結切片を用いてシナプス分子の蛍光免疫染色を行い、STORM法で解析するための標本作製条件を最適化した。ここでは主にシナプス前部に局在し、神経伝達物質の放出に関わる分子群であるMunc13-1、Syntaxin 1A、RIM1、CAST、ELKS、Munc18、SNAP25、電位依存性カルシウムチャネルなどを対象とした。高精細かつ特異性の高いSTORM法による超解像イメージングを行うためには特性の高い抗体の使用が不可欠であるため、市販あるいは自作した抗体について、STORM顕微鏡法への適用の可否を調べた。それぞれの抗体を用いて凍結脳切片の蛍光免疫染色標本を作成し、共焦点レーザー顕微鏡での観察によって、特異性が高く、高精細なSTORMイメージングに耐えうる抗体を選定した。また、複数種類の分子のシナプスでの共局在の様子を調べるために、二重・三重染色に最適な一次抗体及び二次抗体組み合わせや蛍光像の取得条件など多重染色に適した染色及び撮像条件を共焦点レーザー顕微鏡やSTORM顕微鏡を用いたテストイメージングの結果に基づいて決定した。具体的には、3色STORM法に適した蛍光明滅特性（放出光子数、蛍光輝点密度）で、チャネル間での蛍光シグナルの漏れ込みを最小化できるように二次抗体標識に用いる蛍光色素の種類や光学フィルタ―を選定し、合わせて撮像条件の最適化を完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画していた脳組織での多重染色・撮像条件の最適化が順調に進捗し、目標を達成したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までに確立した実験系を用いて、脳内の種々の部位から取得した脳切片を用いて複数種類のシナプス関連分子の免疫染色を行い、シナプス分子を対象としたマルチカラーSTORＭイメージングによって、学習や飼育環境とシナプス分子の微細配置の位置関係の変容との関係を明らかにする。
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