2021 Fiscal Year Annual Research Report
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20H03442
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
宮岡 佑一郎 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, プロジェクトリーダー (20549521)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 朋子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 研究員 (10638802)
高橋 剛 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 研究員 (70802817)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / Cas9 / Cas12a / HR / NHEJ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゲノム編集の再現性を高める、つまり標的DNA配列を毎回狙い通りに改変できる技術の開発を進めている。
接着末端を生じるCas12aでゲノムDNAの2カ所を切断し、その末端配列が互いに相補的になるようにgRNAを設計することにより、予測通りの正確な欠失を導入する手法の開発を進めた。昨年度までに、2分子のCas12aをgRNAのPAMが内側を向く配置にする条件が最適であることを明らかにしていたため、そのgRNAの配向でCas12a分子のDNA切断によって相補的な接着末端、あるいは非相補的な末端を生じるように設計したレンチウイルスを作製し、HEK293T細胞に感染させた後に欠失を誘導した。標的配列をPCRによって増幅し、次世代シークエンスによってゲノム編集結果を解読した。
ドナーDNA配列通りの、正確なゲノム編集が可能になるDNA組換えを促進する分子をスクリーニングするために、ゲノム編集結果を蛍光で検出できるレポーターK562細胞を樹立した。このレポーター細胞に、組換えゲノム編集効率が高いHEK293T細胞cDNAのレンチウイルスライブラリーを感染させた後、ゲノム編集を誘導しDNA組換が起きた細胞とそうでない細胞を分取した。分取した細胞からレンチウイルス特異的な配列のプライマーを用いたPCRで、ウイルスにより細胞に導入されたcDNA配列を同定することを目指したが、非特異的なDNA配列の増幅の抑制が困難であった。そこで、これらの細胞からRNAを抽出し、RNAseqを実施して遺伝子発現を網羅的に比較し、DNA組換えが起きた細胞で特異的に発現している遺伝子を同定する手法を採用することとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２分子のCas12aによる欠失導入では、予定通り相補的、もしくは非相補的な末端配列を生じるレンチウイルスをHEK293T細胞に感染させ、欠失を導入し、その結果を把握するための次世代シークエンスまでを行うことができた。
DNA組換えゲノム編集促進分子スクリーニングでは、DNA組換えが起きた細胞のみをレポーターの蛍光により分取することに成功した。レンチウイルス特異的な配列を持つプライマーを用いたPCRによる、DNA組換え促進分子の同定は行うことができなかったが、RNAseqにより細胞の遺伝子発現全体を把握することにより、DNA組換え促進分子同定への道筋を見出すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cas12aによる欠失導入では、昨年度までに実施した、レンチウイルスを感染させたHEK293T細胞におけるゲノム編集結果を次世代シークエンスで解読したデータを詳細に解析する。具体的には、欠失の大きさや配列の嗜好性を、相補的な末端同士と非相補的な末端同士の結合の場合それぞれにおいて検討する。得られた結果をもとに、筋ジストロフィー症患者由来iPS細胞において、異常を持つエクソンを欠失させるエクソンスキッピングを実施する。ゲノム編集したiPS細胞からDNAを抽出し、設計した通りの配列で欠失を導入できたかを評価する。また、欠失を導入した細胞を骨格筋細胞へと分化誘導し、ジストロフィンタンパク質の発現が回復したかを蛍光免疫染色で評価する。
DNA組換え促進因子のスクリーニングでは、昨年度までに実施したRNAseqの結果から、DNA組換えと非相同性末端結合がそれぞれ生じた細胞において、特定の遺伝子やシグナル伝達経路が活性化し、特にDNA組換え促進に関与している可能性を検討する。それらの遺伝子をK562細胞で強制発現させ、実際にHRが促進されるかを検証する。欠失導入の場合と同様に、得られたDNA組換え促進因子を発現させながら、CRISPR-Cas9によるDNA組換えを筋ジストロフィー症患者由来iPS細胞に誘導し、変異の修正を試みる。DNA組換え促進因子を発現させていない場合と比較して、変異の修復効率が向上することを確認する。また、変異を修正したiPS細胞を骨格筋細胞へと分化誘導し、ジストロフィンタンパク質の発現が回復したかを蛍光免疫染色で評価する。
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Research Products
(15 results)
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[Journal Article] Gain-of-function cardiomyopathic mutations in RBM20 rewire splicing regulation and re-distribute ribonucleoprotein granules within processing bodies2021
Author(s)
Fenix AM, Miyaoka Y, Bertero A, Blue SM, Spindler MJ, Tan KKB, Perez-Bermejo JA, Chan AH, Mayerl SJ, Nguyen TD, Russell CR, Lizarraga PP, Truong A, So PL, Kulkarni A, Chetal K, Sathe S, Sniadecki NJ, Yeo GW, Murry CE, Conklin BR, Salomonis N.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 12
Pages: 6324
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Retinoids rescue ceruloplasmin secretion and alleviate oxidative stress in steatosis models of Wilson’s disease-specific hepatocytes.2021
Author(s)
Dan Song, Gou Takahashi, Yun-Wen Zheng, Mami Matsuo-Takasaki, Jingyue Li, Miho Takami, Yuri An, Yasuko Hemmi, Natsumi Miharada, Tsuyoshi Fujioka, Michiya Noguchi, Takashi Nakajima, Megumu K Saito, Yukio Nakamura, Tatsuya Oda, Yuichiro Miyaoka, Yohei Hayashi
Organizer
Cold Spring Harbor-Asia, Liver Development, Metabolism, Disease & Cancer Meeting
Int'l Joint Research
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