2022 Fiscal Year Annual Research Report
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20H03442
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
宮岡 佑一郎 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, プロジェクトリーダー (20549521)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 朋子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 研究員 (10638802)
高橋 剛 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 研究員 (70802817)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / Cas9 / Cas12a / HR / NHEJ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゲノム編集の再現性を高め、標的DNA配列を毎回狙い通りに改変できる技術の開発を進めてきた。
接着末端を生じるCas12aでゲノムDNAの２カ所を切断し、その末端配列が互いに相補的になるようにgRNAを設計することにより、予測通りの正確な欠失を導入する手法の開発を進めた。昨年度までに、Cas12a分子の２カ所のDNA切断によって４塩基の相補的な接着末端、あるいは非相補的な末端を生じるように設計したレンチウイルスを作製し、HEK293T細胞に感染させた後に欠失を誘導した。その編集結果を次世代シークエンスによってゲノム解読したところ、接着末端同士を生じさせた場合は確かに４塩基末端同士の正確な結合が起こり、その割合は全体の6.1%程度であった。一方で、ランダムな配列の４塩基末端にしたところ、その４塩基末端同士で結合が起きたのは全体の約0.6%に過ぎなかった。その中で最も頻繁に観察された結合部分の塩基配列はTAGCであった。引き続き、バーコード配列をたよりに、元の末端配列と結果として生じた結合配列の照合を行い、狙い通りの欠失を誘導するための至適な配列の探索を進めている。
ドナーDNA配列通りの、正確なゲノム編集が可能になるDNA組換えを促進する分子を、昨年度までに樹立した蛍光レポーターK562細胞を用いてスクリーニングした。HRが起きた細胞とNHEJが起きた細胞を蛍光をもとに選別し、RNAseqにより遺伝子発現解析を行った。その結果、HRが起きた細胞で、UV照射への反応や細胞分裂に関わる遺伝子が多く同定されており、DNA組換え促進分子を探索するスクリーニング系が機能していることが示唆された。HRが起きた細胞集団で特に発現が高かった５遺伝子を候補とし、HEK293T細胞に強制発現させながらゲノム編集を行ったところ、２つの遺伝子でNHEJを抑制する活性が認められた。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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